鳖甲煎丸调控AKT/mTOR信号通路在肝癌细胞有氧糖酵解中的作用

谭钦文; 黄晶晶; 钟瑞熙; 杜沅沁; 徐健; 农金丽; 彭玉姣

doi:10.12449/JCH250216

鳖甲煎丸调控AKT/mTOR信号通路在肝癌细胞有氧糖酵解中的作用

DOI: 10.12449/JCH250216

谭钦文¹,
黄晶晶^{2, 3, , ,},
钟瑞熙¹,
杜沅沁¹,
徐健¹,
农金丽¹,
彭玉姣¹

1.
广西中医药大学研究生院，南宁 530023
2.
广西中医药大学第一附属医院脾胃肝病科，南宁 530023
3.
广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁 530023

基金项目:

广西自然科学基金 (2022GXNSFAA035460);

广西自然科学基金 (2024GXNSFDA010005);

广西研究生教育创新计划项目 (YCSW2023395);

广西研究生教育创新计划项目 (YCSY2023021);

广西中医药大学引进博士科研启动基金项目 (2022BS026)

伦理学声明：本研究方案于2023年8月30日经由广西中医药大学伦理委员会审批，批号：DW20230830-162，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：谭钦文、钟瑞熙负责课题设计，起草论文；谭钦文、钟瑞熙、杜沅沁、徐健负责实验操作，研究过程的实施；谭钦文负责数据收集，统计学分析，绘制图表；杜沅沁、农金丽、彭玉姣负责拟定写作思路；黄晶晶指导撰写文章并最后定稿。

详细信息

通信作者:
黄晶晶， 55869563@qq.com （ORCID： 0000-0002-4932-0838）

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出版历程
- 收稿日期: 2024-06-22
- 录用日期: 2024-09-24
- 出版日期: 2025-02-25

Effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating the protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway

1.
Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China
2.
Department of Spleen，Stomach and Hepatology，The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China
3.
Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine，Nanning 530023，China

Research funding:

Guangxi Natural Science Foundation (2022GXNSFAA035460);

Guangxi Natural Science Foundation (2024GXNSFDA010005);

Guangxi Graduate Education Innovation Program (YCSW2023395);

Guangxi Graduate Education Innovation Program (YCSY2023021);

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine Introduction of Doctoral Research Fund Project (2022BS026)

More Information

Corresponding author: HUANG Jingjing， 55869563@qq.com （ORCID： 0000-0002-4932-0838）

摘要

摘要: 目的利用细胞实验探索鳖甲煎丸对肝细胞癌增殖、迁移及有氧糖酵解的抑制作用，并探索其内在机制。方法选取人肝癌细胞株（Huh7）作为研究对象，随机将SD大鼠分为空白血清组、鳖甲煎丸高、中、低剂量组及抑制剂组，制备含药大鼠血清，用以孵育Huh7细胞。CCK-8、划痕实验探索鳖甲煎丸对肝癌细胞的增殖、迁移的影响，糖酵解限速酶及代谢产物检测探索鳖甲煎丸对肝癌细胞有氧糖酵解的影响，RT-qPCR、Western Blot实验探索鳖甲煎丸对AKT/mTOR信号通路的mRNA、相关蛋白及磷酸化的表达。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t或Dunnettg T3检验。结果与空白血清组相比，鳖甲煎丸组的OD值、不同时间段的迁移率、糖酵解限速酶（己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶）及糖酵解代谢产物（丙酮酸、乳酸、ATP）检测均显著降低（P值均<0.05）；RT-qPCR结果显示，与空白血清组比较，鳖甲煎丸高、中、低剂量组的mTOR mRNA表达水平均下调，高、低剂量组的AKT mRNA表达水平下调（P值均<0.05）；Western Blot 结果显示，与空白血清组比较，鳖甲煎丸高、中、低剂量组的mTOR相关蛋白及磷酸化蛋白表达水平均下调，高、中剂量组的AKT相关蛋白及磷酸化蛋白表达水平均下调（P值均<0.05）。结论初步验证了鳖甲煎丸含药血清可以抑制人肝癌细胞Huh7细胞的有氧糖酵解，从而抑制其增殖、迁移，其机制可能与抑制AKT/mTOR信号通路的相关蛋白表达有关。
- 鳖甲煎丸 /
- 肝肿瘤，实验性 /
- 瓦尔堡效应，肿瘤学
Abstract: Objective To investigate the inhibitory effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation， migration， and aerobic glycolysis of hepatocellular carcinoma （HCC） using cell experiments， as well as related mechanisms. Methods Human liver cancer cell line Huh7 was selected， and Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank serum group， inhibitor group， and high-， middle-， and low-dose Biejia Decoction Pill groups. Rat serum containing the drug was prepared for the incubation of Huh7 cells. CCK8 assay and scratch assay were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the proliferation and migration of HCC cells； glycolytic rate-limiting enzymes and metabolites were measured to explore the effect of Biejia Decoction Pill on aerobic glycolysis of liver cancer cells； RT-qPCR and Western blot were used to explore the effect of Biejia Decoction Pill on the mRNA expression， related proteins， and phosphorylation of the protein kinase B （AKT）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the least significant difference t-test or the Dunnett’s T3 test were used for further comparison between two groups. Results Compared with the blank serum group， the Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in OD value， migration rate during different periods of time， glycolytic rate-limiting enzymes （hexokinase， phosphofructokinase， pyruvate kinase）， and glycolytic metabolites （pyruvate， lactic acid， ATP）（all P<0.05）. RT-qPCR results showed that compared with the blank serum group， the high-， middle-， and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of mTOR， and the high- and low-dose Biejia Decoction Pill groups had a significant reduction in the mRNA expression level of AKT （all P<0.05）. Western blot results showed that compared with the blank serum group， the high-， middle-， and low-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of mTOR-related proteins and phosphorylated proteins， and the high- and middle-dose Biejia Decoction Pill groups had significant reductions in the expression levels of AKT-related proteins and phosphorylated proteins （all P<0.05）. Conclusion This study preliminarily verifies that the serum containing Bijia Decoction Pill can inhibit the aerobic glycolysis of human hepatoma Huh7 cells， thereby inhibiting their proliferation and migration， possibly by inhibiting the expression of the proteins related to the AKT/mTOR signaling pathway.
- Bie Jia Jian Wan /
- Liver Neoplasms， Experimental /
- Warburg Effect， Oncologic

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图 1 各组细胞划痕图片

Figure 1. Cell scratch pictures for each group

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图 2 Western Blot条带图

Figure 2. Western Blot strip diagram

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表 1 各组细胞OD值检测结果

Table 1. Test results of cell OD value in each group

组别	细胞增殖（OD值）
空白血清组	2.07±0.02
低剂量组	1.55±0.05^1）
中剂量组	1.22±0.08^1）
高剂量组	1.13±0.04^1）
抑制剂组	0.90±0.05^1）
F值	332.81
P值	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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表 2 各组细胞24、48 h的迁移率比较

Table 2. Comparison of 24 h and 48 h mobility of cells in each group

组别	24 h迁移率	48 h迁移率
空白血清组	0.385±0.017	0.891±0.009
低剂量组	0.311±0.024^1）	0.850±0.005^1）
中剂量组	0.301±0.025^1）	0.774±0.016^1）
高剂量组	0.129±0.025^1）	0.740±0.021^1）
抑制剂组	0.059±0.035^1）	0.677±0.005^1）
F值	83.60	137.73
P值	<0.001	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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表 3 各组细胞糖酵解限速酶活性

Table 3. Cell glycolytic rate-limiting enzyme activities in each group

组别	HK活性（μg/mL）	PFK活性（U/mg）	PK活性（U/mg）
空白血清组	13.62±0.42	36.43±2.02	628.57±23.98
低剂量组	12.29±0.69^1）	35.16±0.43^1）	582.52±21.60^1）
中剂量组	8.39±0.58^1）	26.22±0.98^1）	525.14±5.21^1）
高剂量组	10.23±0.82^1）	28.56±0.49^1）	527.28±13.36^1）
抑制剂组	5.43±0.58^1）	21.75±0.12^1）	472.42±24.12^1）
F值	78.78	98.75	29.41
P值	<0.001	<0.001	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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表 4 各组细胞糖酵解代谢产物水平

Table 4. Levels of glycolytic metabolites in each group

组别	丙酮酸（μmol/mg）	乳酸（μmol/g）	ATP活性（μmol/10⁶个）
空白血清组	0.451±0.009	3.709±0.113	0.083±0.003
低剂量组	0.366±0.008^1）	2.818±0.048^1）	0.072±0.001^1）
中剂量组	0.188±0.006^1）	2.062±0.032^1）	0.057±0.003^1）
高剂量组	0.178±0.003^1）	1.781±0.047^1）	0.053±0.002^1）
抑制剂组	0.144±0.006^1）	1.319±0.021^1）	0.047±0.002^1）
F值	1 222.53	707.09	88.49
P值	<0.001	<0.001	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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表 5 AKT、mTOR的mRNA水平

Table 5. mRNA levels of AKT and mTOR

组别	AKT	mTOR
空白血清组	0.98±0.03	1.06±0.21
低剂量组	0.74±0.11^1）	0.64±0.12^1）
中剂量组	0.86±0.10	0.53±0.08^1）
高剂量组	0.73±0.21^1）	0.54±0.11^1）
抑制剂组	0.33±0.09^1）	0.15±0.03^1）
F值	12.10	19.73
P值	0.001	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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表 6 p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表达水平

Table 6. Expression levels of P-AKT/AKT and P-mTOR/mTOR

组别	p-AKT/AKT	p-mTOR/mTOR
空白血清组	1.09±0.15	1.29±0.16
低剂量组	1.07±0.13	0.95±0.14^1）
中剂量组	0.72±0.09^1）	0.71±0.08^1）
高剂量组	0.55±0.07^1）	0.51±0.06^1）
抑制剂组	0.37±0.05^1）	0.23±0.03^1）
F值	124.00	82.98
P值	<0.001	<0.001
注：与空白血清组比较，1）P<0.05。

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