肝移植是治疗终末期肝病的有效疗法，免疫排斥是限制肝移植发展的重要因素^［1-2］。肝移植术后常用的免疫抑制剂（immunosuppressive，IS）包括：钙调磷酸酶抑制剂、霉酚酸酯、雷帕霉素、糖皮质激素等，长期使用这些药物存在较多不良反应^［3-5］。因此，肝移植术后免疫抑制治疗的研究方向是寻找新型药物，在抑制免疫排斥和降低IS毒副作用之间取得平衡。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节免疫等作用，被认为是肝病治疗的理想药物^［6-9］。本研究建立原位肝移植大鼠模型，探讨单用MSC、单用IS、MSC联合IS抑制大鼠肝移植免疫排斥反应的效果，为进一步研究MSC在大鼠肝移植中的应用奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

3周龄清洁级雄性F344大鼠，体质量50～70 g，用来提取MSC；8周龄清洁级雄性F344大鼠，体质量260～270 g，为肝移植供体；8周龄清洁级雄性Lewis大鼠，体质量275～285 g，为肝移植受体。以上实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK（京）2019-0008，实验动物使用许可证编号：SYXK（闽）2022-0003。

1.2   实验试剂

α-MEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；双抗（美国Gibco公司）；0.25%胰酶（美国Gibco公司）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝公司）；Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝公司）；CD3抗体（武汉赛维尔公司）；CD56抗体（武汉赛维尔公司）。

1.3   实验方法

1.3.1   MSC的体外分离、培养和鉴定

将3周龄F344大鼠处死，无菌分离双下肢骨，用α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔，移入培养瓶中，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱培养。2 h后吸取上清，继续培养，去除快速贴壁细胞。24 h后更换培养基，去除不贴壁细胞。以后每隔2 d更换培养基，直至细胞融合度达到90%，用0.25%胰酶消化，传代培养。后续实验均使用P3代细胞。

将P3代细胞消化、重悬，PBS清洗2次，使用5%BSA孵育20 min，PBS清洗2次，分别加入含CD44、CD105、CD34、CD31的0.5% BSA，室温避光孵育30 min，PBS清洗2次，上机检测。

1.3.2   大鼠肝移植模型建立与分组

采用Kamada双袖套法，不重建肝动脉^［10］。F344大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，其中供体体质量略小于受体。各组手术无肝期为13～15 min，总时间为100～120 min，差异无统计学意义。术后大鼠单笼喂养，自由饮水、进食。

实验分为5组，每组8只大鼠。Normal组：正常大鼠，即不进行任何干预的正常大鼠；其余组均进行大鼠原位肝移植，PS组注射生理盐水；MSC组注射MSC（分别在术前7 d、手术当天、术后7 d、术后15 d注射，每次每只大鼠注射3×10⁶ MSC）；IS组注射IS（氢化可的松0.75 mg·kg^-1·d^-1、环孢霉素1 mg·kg^-1·d^-1），MSC+IS组注射MSC和IS。

1.3.3   病理切片染色

取肝移植术后15 d肝组织，用4%多聚甲醛室温固定24 h，石蜡包埋，切片。分别使用苏木素伊红（HE）染色试剂盒和Masson染色试剂盒染色，封片镜检。Masson染色结果使用Image J软件量化。

1.3.4   免疫组化

取肝移植术后15 d肝组织，用4%多聚甲醛室温固定24 h，石蜡包埋，切片。切片常规脱蜡至水，EDTA抗原修复，3%的双氧水处理，血清封闭，一抗4 ℃过夜孵育，二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木素染核，封片镜检，阳性细胞数使用Image J软件量化。

1.3.5   免疫荧光

取肝移植术后15 d肝组织，用4%多聚甲醛室温固定24 h，石蜡包埋，切片。切片常规脱蜡至水，EDTA抗原修复，血清封闭，一抗4 ℃过夜孵育，二抗室温孵育2 h，DAPI染核，封片镜检，共定位细胞占比使用Image J软件量化。

1.4   统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5进行数据分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存分析采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   MSC的鉴定

原代培养2 d时细胞呈梭形，细胞轮廓清晰（图1）。原代培养10 d左右细胞融合度达到90%，传代后生长良好，杂细胞减少。利用流式细胞仪检测MSC的表面标志物，结果显示P3代细胞的纯度高，细胞表面抗原CD44、CD105、CD34、CD31的阳性率分别为97.7%、94.3%、2.02%、1.55%（图2）。

图  1  MSC的外形鉴定（×20）

Figure  1.  Shape identification of MSC（×20）

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图  2  MSC的表型鉴定

Figure  2.  Phenotypic identification of MSC

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2.2   生存分析

每组各留5只大鼠观察生存期，共观察60 d。其中Normal组无死亡，PS组在术后20 d之内全部死亡，MSC组和IS组在观察结束时均存活2只，MSC+IS组在观察结束时仅1只死亡（图3）。与Normal组相比，PS组大鼠生存期显著缩短（P<0.001）。与PS组相比，MSC+IS组大鼠生存期显著延长（P<0.05）。其余组别之间均无统计学差异（P值均>0.05）。

图  3  大鼠肝移植后Kaplan-Meier生存曲线

Figure  3.  Kaplan-Meier survival curve after liver transplantation in rats

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2.3   各组大鼠肝组织病理学检查结果的比较

肝移植术后第15天，各组大鼠均发生不同程度的排斥反应。HE染色结果（图4）显示：PS组汇管区大量炎症细胞浸润，肝窦结构紊乱，静脉内皮炎症明显，大部分胆管结构不完整，炎症累及周围肝实质；MSC组和IS组部分汇管区可见炎症细胞浸润；MSC+IS组几乎没有汇管区存在炎症细胞浸润，其肝组织结构接近于Noraml组。4组相比较，PS组排斥反应程度最高，MSC组和IS组程度相似，MSC+IS组排斥程度最低。根据Masson染色结果（图4、5）可知：PS组纤维化程度最高（15.46±0.79）%，MSC+IS组程度最低（3.60±0.54）%。与Normal组相比，PS组纤维化程度显著升高（P<0.000 1）。与PS组相比，MSC组、IS组和MSC+IS组纤维化程度均显著降低（P值均<0.000 1）。MSC+IS组纤维化程度显著低于MSC组和IS组（P值均<0.000 1）。

图  4  各组大鼠肝组织病理切片

Figure  4.  Histopathological sections of rat liver in various groups

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图  5  大鼠肝移植术后肝组织纤维化程度统计图

Figure  5.  Statistical graph of the degree of fibrosis in liver tissue after liver transplantation in rats

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2.4   各组大鼠肝组织T淋巴细胞和NK细胞浸润情况

选择CD56和CD3两个指标进行免疫组化染色，观察大鼠肝组织T淋巴细胞和NK细胞的浸润情况。T淋巴细胞和NK细胞都主要分布在汇管区，个别T淋巴细胞浸润到肝实质（图6a）。统计结果如图所示（图6b、c），PS组中T淋巴细胞和NK细胞浸润最严重，MSC+IS组浸润程度最低。与Normal组相比，PS组T淋巴细胞和NK细胞浸润程度显著升高（P<0.000 1）。与PS组相比，MSC组、IS组和MSC+IS组T淋巴细胞与NK细胞浸润程度显著降低（P值均<0.000 1）。

注： a，免疫组化染色（×40）；b、c，CD56、CD3阳性细胞占比统计结果。

图  6  各组大鼠肝组织CD56、CD3指标免疫组化染色

Figure  6.  Immunohistochemical staining of rat liver tissue for CD56 and CD3 indicators in each group

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2.5   各组大鼠肝组织巨噬细胞M2极化情况

CD68（巨噬细胞标志物）和CD163（巨噬细胞M2极化相关标志物）双重免疫荧光染色结果显示，与Normal组相比，PS组中CD68和CD163共定位细胞数占比显著降低（P<0.05）；与PS组相比，MSC组、IS组和MSC+IS组中共定位占比显著增加（P值均<0.000 1），且MSC+IS组与MSC组及IS组相比差异均有统计学意义（P值均<0.000 1）（图7、8）。

注： DAPI、CD68、CD163与Merge放大倍数为20，Enlarge放大倍数为63。

图  7  各组大鼠肝组织免疫荧光染色

Figure  7.  Immunofluorescence staining of rat liver tissue in each group

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图  8  各组大鼠肝组织巨噬细胞M2型极化占比统计图

Figure  8.  Statistics of the percentage of macrophage M2 type polarisation in liver tissue of rats in each group

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3.   讨论

MSC是一类多能干细胞，具有多向分化潜能和免疫调节作用。其表面低表达组织相容性复合物，具有低免疫原性，不刺激体内免疫反应^［8］。多项体内、体外实验^［11-13］均表明，MSC可向肝细胞分化，修复受损肝组织，降低炎症反应。本研究同样证实了MSC具有免疫调节作用，其抑制大鼠肝移植免疫排斥反应能力与IS相当，但不论是MSC还是IS均未达到最理想疗效。

免疫排斥反应是肝移植术后常见的病理生理过程，是导致肝移植失败的重要原因^［14］。目前，尚无统一的肝移植术后IS治疗标准，多采用以钙调磷酸酶抑制剂为基础，联合其他药物的免疫抑制方案。常用的三联免疫抑制方案为钙调磷酸酶抑制剂+霉酚酸酯+糖皮质激素，常用的二联免疫抑制方案为钙调磷酸酶抑制剂+霉酚酸酯/糖皮质激素^［3］。由于IS的毒副作用，针对特殊肝移植受者，如：肾功能损伤、糖尿病、高血压等，常规二联和三联免疫抑制方案的使用受限，现有IS方案已不能满足临床需求^［15-16］。

本研究通过构建原位肝移植大鼠模型，注射MSC和IS，观察MSC联合IS抑制免疫排斥的能力。结果显示：与MSC组和IS组相比，MSC+IS组术后15 d肝组织炎症细胞浸润明显少于MSC组和IS组，肝小叶结构完整，基本接近于Normal组。且MSC+IS组降低大鼠肝移植引起的纤维化程度的能力也比MSC组和IS组强。免疫组化进一步分析肝组织炎症细胞浸润情况，结果发现：PS组可见大量T淋巴细胞和NK细胞浸润，MSC组和IS组的浸润明显减少，MSC+IS组仅见少量T淋巴细胞和NK细胞浸润。巨噬细胞M2极化可抑制免疫反应，因此，在肝移植术后增加巨噬细胞M2极化有助于抑制免疫反应，本研究免疫荧光实验也表明，MSC+IS组可以显著增加巨噬细胞M2极化，抑制免疫反应。

综上所述，MSC联合IS可以抑制大鼠原位肝移植免疫排斥反应。