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中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定
DOI: 10.12449/JCH240210
Preliminary identification of the cloning， expression， and function of Marmota himalayana type I interferon receptor β subunit
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摘要:
目的 克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基（mhIFNAR2）的基因，并进行抗体制备及功能鉴定。 方法 应用RT-PCR技术，从中国旱獭脾组织中扩增得到序列，克隆至原核表达载体pRSET-B，表达重组蛋白，电泳和Western Blot法鉴定；重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体，免疫组化、免疫荧光和Western Blot法鉴定；再通过siRNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 从mhIFNAR2扩增出149～1 300 bp片段，其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高，可达98.05%。成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2（50-181aa）蛋白的原核表达质粒，命名为pRSET-B.mhIFNAR2；其表达重组蛋白分子量27 kD，纯化后纯度约为95%，浓度约为160 μg/mL。用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后，获得1∶1 000的特异性多克隆抗体，用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达。合成的三条siRNA，其中有一条起始于277位点的siRNA（siRNA277）与空白对照及阴性对照相比，可以沉默目的基因的表达，并能减弱干扰素的信号通路（P值均<0.05）。 结论 获得mhIFNAR2的部分序列，成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，并能用于免疫组化、免疫荧光及Western Blot的检测。用siRNA277可以抑制目的基因的表达，并能阻断干扰素的信号通路。 Abstract:Objective To clone the gene of Marmota himalayana type Ⅰ interferon receptor β subunit （mhIFNAR2）， and to perform antibody preparation and functional identification. Methods RT-PCR was used for amplification in the spleen tissue of Marmota himalayana to obtain the sequence， which was cloned to the prokaryotic expression vector pRSET-B to express the recombinant protein. Electrophoresis and Western blot were used for identification. BALB/c mice were immunized with the recombinant protein to prepare the polyclonal antibody of its extracellular domain； immunohistochemistry， immunofluorescence assay， and Western Blot were used for identification， and the method of siRNA blockade was used to investigate its function. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for comparison between two groups. Results A fragment of mhIFNAR2 （149 — 1 300 bp） was obtained from spleen tissue， which showed the highest homology of 98.05% in marmot. A prokaryotic expression plasmid was successfully constructed for expression of the extracellular domain of the mhIFNAR2（50-181aa） and was named pRSET-B.mhIFNAR2， and the recombinant protein expressed by this plasmid had a molecular weight of 27 kD， a purity of about 95% after purification， and a concentration of 160 μg/mL. After BALB/c mice were immunized with the purified recombinant protein， 1∶1 000 specific polyclonal antibodies were obtained， and immunohistochemistry and immunofluorescence assay showed the expression in cell membrane and cytoplasm. Among the three siRNAs synthesized， the siRNA starting from the 277 locus （siRNA277） could silence the expression of target genes and weaken the interferon signaling pathway compared with the blank control group and the negative control group （both P<0.05）. Conclusion The fragment of mhIFNAR2 is obtained， and the polyclonal antibody for the extracellular domain of mhIFNAR2 is successfully prepared， with relatively high titer and specificity， and can be used for immunohistochemistry， immunofluorescence assay， and Western blot. -
Key words:
- Receptor， Interferon alpha-beta /
- Clone /
- Hepatitis B
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肝硬化是一种常见的慢性晚期进行性肝病，全球每年约132万人因此死亡，是最常见的死亡原因之一［1］。急性上消化道出血（acute upper gastrointestinal bleeding， AUGIB）是肝硬化的常见并发症［2-3］，也是肝硬化患者死亡的重要原因，且6周病死率可达20%以上［4］。目前评估肝硬化并发AUGIB患者短期内（6周）死亡及再出血的预后研究较少，本研究拟通过结合国内外对血小板-白蛋白-胆红素指数（platelet-albumin-bilirubin index， PALBI）及AIMS65评分的最新研究进展，与目前应用较多的Child-Turcotte-Pugh（CTP）评分、终末期肝病模型（MELD）评分进行比较，对肝硬化并发AUGIB患者短期内再出血及死亡情况进行预测，从而评估PALBI评分与AIMS65评分联合检测的预测价值。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2021年2月—2022年10月在本院住院治疗的肝硬化并发AUGIB患者临床资料。纳入标准：（1）肝硬化的诊断符合2019年版《肝硬化诊治指南》［5］；（2）因呕血或黑便等症状入院，并确诊为急性期（<5 d）上消化道出血者；（3）在本院住院治疗（入院后均行药物和/或内镜止血治疗），临床病例资料齐全。排除标准：（1）入院时或住院期间合并心脑血管疾病或心力衰竭患者；（2）入院时为非急性期（≥5 d）发生AUGIB患者；（3）合并消化道恶性肿瘤者（肝癌除外）；（4）合并重症感染疾病者；（5）入院时缺乏相关数据资料，拒绝随访或电话信息缺失者，不配合治疗和血液学指标采集者，相关评分无法计算；（6）重复入院不除外，但不包含6周内再度由于AUGIB入院的患者。
1.2 研究方法
通过查阅病历资料、电话随访等方式收集患者的基本临床资料，包括一般情况（年龄、性别、肝硬化病因、伴随疾病、既往静脉曲张病史等）；入院时血压；入院24 h临床症状（呕血、黑便、精神改变等）；入院5 d内并发症情况（腹水、合并细菌感染、肝性脑病、门静脉血栓等）。所有患者均在入院后次日清晨空腹抽取静脉血，检测血常规、肝功能、肾功能及凝血四项等生化指标，分别计算AIMS65评分、PALBI评分、CTP评分、MELD评分，并比较4种评分对患者再出血的预测能力。计算公式分别为：（1）PALBI＝2.02×log10［TBil（μmol/L）］－0.37×｛log10［TBil（μmol/L）］｝2－0.04×Alb（g/L）－3.48×log10［PLT（103/μL）］+1.01×｛log10［PLT（103/μL）］｝2，PALBI分为3级，≤-2.53分为1级，>-2.53分且≤-2.09分为2级，>-2.09分为3级［6］。（2）AMIS65评分：Alb<3 g/dL、收缩压<90 mmHg、意识改变、年龄>65岁以及国际标准化比值（INR）>1.5均为1分，反之为0分，评分为各指标之和。0～1分：低危；2～5分：高危［7］。（3）MELD＝3.8×ln［TBil（mg/dL）］+11.2×ln（INR）+9.6×ln［Cr（mg/dL）］+6.4×（病因：胆汁淤积性或酒精性为0，其他为1）［8］。（4）CTP评分计算方式［9］见表1。
表 1 CTP评分Table 1. CTP rating scale指标 1分 2分 3分 腹水 无 轻度 中、重度 肝性脑病 无 1～2 3～4 Alb（g/L） >35 28～35 <28 TBil（µmol/L） <34 34～51 >51 PT（s） <4 4～6 >6 注：A级，5～6分；B级，7～9分；C级，10分及以上。 1.3 随访
以患者入院为研究起点，通过查阅病历资料及电话随访，主要随访终点为死亡，次要随访终点为再出血，当患者出现死亡或随访满6周即终止。
1.4 统计学方法
应用SPSS 26软件和MedCalc v19.5.3 进行统计学分析。正态分布的计量资料以
2. 结果
2.1 基线特征
共纳入238例肝硬化并发AUGIB患者，其中男162例，女76例；年龄（59.68±11.31）岁。纳入患者基线特征详见表2。
表 2 所有纳入患者的基线特征Table 2. Baseline characteristics of all included patients指标 数值 男/女（例） 162/76 呕血［例（%）］ 103（43.28） 黑便［例（%）］ 177（74.37） 既往有静脉曲张病史［例（%）］ 69（28.99） 腹水［例（%）］ 54（22.69） 肝性脑病［例（%）］ 50（21.01） 高血压［例（%）］ 42（17.65） 糖尿病［例（%）］ 52（21.85） 吸烟史［例（%）］ 99（41.60） 饮酒史［例（%）］ 108（45.38） 年龄（岁） 59.68±11.31 收缩压（mmHg） 115.00（104.00～132.75） PLT（×109/L） 102.60（65.58～158.48） Hb（g/L） 73.45（56.80～95.28） WBC（×109/L） 6.60（4.31～8.96） ALT（U/L） 23.00（16.00～36.00） AST（U/L） 32.00（22.00～57.50） ALP（U/L） 89.00（62.00～130.00） GGT（U/L） 48.50（23.25～133.25） Alb（g/L） 28.90（24.48～33.00） TBil（µmol/L） 26.10（16.70～46.98） Cr（µmol/L） 69.85（55.10～96.65） INR 1.42（1.29～1.67） PT（s） 15.15（13.72～17.98） CTP评分 7.00（6.00～9.00） MELD评分 7.75（3.66～13.06） AIMS65评分 2.00（1.00～3.00） PALBI评分 -1.87±0.49 2.2 生存组与死亡组、再出血组与未再出血组患者的临床资料及生化指标分析
肝硬化并发AUGIB患者中65例入院治疗后6周内死亡，病死率为27.3%；89例患者发生再出血，再出血率为37.4%。死亡组与生存组患者比较，呕血、既往有静脉曲张病史、Alb、TBil、INR、Cr、PT、收缩压、PALBI评分、AIMS65评分、CTP评分和MELD评分差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表3）。再出血与未再出血组比较，呕血、糖尿病病史、Alb、TBil、INR、Cr、PT、PALBI评分、AIMS65评分、CTP评分和MELD评分差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表4）。
表 3 生存组和死亡组一般资料及生化指标比较Table 3. Comparison of general data and biochemical indexes between survival group and death group指标 生存组（n=173） 死亡组（n=65） 统计值 P值 男/女（例） 119/54 43/22 χ2=0.151 0.698 年龄（岁） 59.23±11.57 60.89±10.60 t=-1.009 0.314 呕血［例（%）］ 54（31.21） 49（75.38） χ2=37.552 <0.001 黑便［例（%）］ 134（77.46） 43（66.15） χ2=3.167 0.075 既往有静脉曲张［例（%）］ 44（25.43） 25（38.46） χ2=3.895 0.048 腹水［例（%）］ 40（23.12） 14（21.54） χ2=0.067 0.795 肝性脑病［例（%）］ 32（18.50） 18（27.69） χ2=2.407 0.121 高血压［例（%）］ 29（16.76） 13（20.00） χ2=0.341 0.559 糖尿病［例（%）］ 43（24.86） 9（13.85） χ2=3.354 0.067 吸烟史［例（%）］ 77（44.51） 22（33.85） χ2=2.211 0.137 饮酒史［例（%）］ 80（46.24） 28（43.08） χ2=0.191 0.662 肝硬化病因［例（%）］ χ2=15.073 0.237 HBV 61（35.26） 17（26.15） HCV 11（6.36） 4（6.15） 酒精性 67（38.73） 20（30.77） 原发胆汁性 13（7.51） 1（1.54） 自身免疫性 3（1.73） 1（1.54） 隐源性 30（17.34） 23（35.38） 病毒性合并酒精性 67（38.73） 1（1.54） 收缩压（mmHg） 119.00（107.00～133.00） 107.00（86.00～127.00） Z=-3.747 <0.001 PLT（×109/L） 99.00（64.60～143.20） 118.20（69.60～198.60） Z=-1.913 0.056 Hb（g/L） 71.90（56.70～95.80） 78.10（56.80～94.00） Z=-0.726 0.468 WBC（×109/L） 6.41（4.01～8.76） 7.34（5.41～9.22） Z=-1.819 0.069 ALT（U/L） 23.00（14.00～36.00） 23.00（17.00～34.00） Z=-0.550 0.583 AST（U/L） 32.00（21.00～55.00） 36.00（25.00～72.00） Z=-1.513 0.130 ALP（U/L） 87.00（61.00～125.00） 94.00（65.00～156.00） Z=-1.579 0.114 GGT（U/L） 45.00（22.00～112.00） 65.00（28.00～159.00） Z=-1.598 0.110 Alb（g/L） 30.00（26.00～34.00） 25.00（22.00～28.50） Z=-5.009 <0.001 TBil（µmol/L） 22.70（15.40～36.10） 35.60（26.00～92.00） Z=-4.912 <0.001 Cr（umol/L） 64.10（54.40～83.30） 86.30（70.10～174.00） Z=-4.645 <0.001 INR 1.36（1.28～1.57） 1.64（1.41～2.03） Z=-4.394 <0.001 PT（s） 14.60（13.70～16.80） 17.30（14.40～21.90） Z=-4.039 <0.001 CTP评分 7.00（6.00～8.00） 9.00（7.00～11.00） Z=-6.228 <0.001 MELD评分 6.12（2.33～9.95） 13.51（9.17～22.69） Z=-7.073 <0.001 AIMS65评分 1.00（0.00～2.00） 3.00（2.00～3.00） Z=-9.062 <0.001 PALBI评分 -2.00±0.47 -1.52±0.38 t=-7.398 <0.001 表 4 未再出血组和再出血组一般资料及生化指标比较Table 4. Comparison of general data and biochemical indexes between non-rebleeding group and rebleeding group指标 未再出血组（n=149） 再出血组（n=89） 统计值 P值 男/女（例） 102/47 60/29 χ2=0.028 0.868 年龄（岁） 59.36±11.80 60.22±10.50 t=-0.568 0.571 呕血［例（%）］ 49（32.89） 54（60.67） χ2=17.527 <0.001 黑便［例（%）］ 111（74.50） 66（74.16） χ2=0.003 0.954 既往有静脉曲张［例（%）］ 37（24.83） 32（35.96） χ2=3.348 0.067 腹水［例（%）］ 31（20.81） 23（25.84） χ2=0.806 0.369 肝性脑病［例（%）］ 30（20.13） 20（22.47） χ2=0.183 0.668 高血压［例（%）］ 25（16.78） 17（19.10） χ2=0.207 0.649 糖尿病［例（%）］ 39（26.17） 13（14.61） χ2=4.367 0.037 吸烟史［例（%）］ 68（45.64） 31（34.83） χ2=2.678 0.102 饮酒史［例（%）］ 69（46.31） 39（43.82） χ2=0.139 0.709 肝硬化病因［例（%）］ χ2=10.853 0.542 HBV 52（34.90） 26（29.21） HCV 9（6.04） 6（6.74） 酒精性 56（37.58） 31（34.83） 原发胆汁性 12（8.05） 2（2.25） 自身免疫性 2（1.34） 2（2.25） 隐源性 29（19.46） 24（26.97） 病毒性合并酒精性 9（6.04） 2（2.25） 收缩压（mmHg） 117.00（106.00～132.00） 110.00（94.00～137.00） Z=-1.174 0.241 PLT（×109/L） 98.90（65.50～139.20） 115.80（65.80～184.30） Z=-1.585 0.113 Hb（g/L） 70.70（54.90～94.60） 76.20（61.30～96.40） Z=-1.446 0.148 WBC（×109/L） 6.56（3.97～8.62） 7.08（5.05～9.44） Z=-1.654 0.098 ALT（U/L） 22.00（14.00～36.00） 23.00（17.00～37.00） Z=-0.976 0.329 AST（U/L） 30.00（21.00～54.00） 35.00（25.00～80.00） Z=-1.943 0.052 ALP（U/L） 85.00（61.00～129.00） 93.00（65.00～140.00） Z=-1.135 0.256 GGT（U/L） 45.00（22.00～108.00） 64.00（27.00～158.00） Z=-1.676 0.094 Alb（g/L） 29.00（26.00～33.00） 26.10（23.00～31.00） Z=-3.232 0.001 TBil（µmol/L） 22.90（15.40～34.00） 32.70（19.80～86.90） Z=-3.966 <0.001 Cr（µmol/L） 63.90（54.20～81.50） 84.60（61.60～155.00） Z=-4.584 <0.001 INR 1.37（1.29～1.58） 1.53（1.28～1.81） Z=-2.606 0.009 PT（s） 14.60（13.80～17.00） 16.00（13.70～19.60） Z=-2.482 0.013 CTP评分 7.00（6.00～8.00） 9.00（7.00～10.00） Z=-4.717 <0.001 MELD评分 6.35（2.31～9.44） 11.24（5.77～21.07） Z=-5.661 <0.001 AIMS65评分 1.00（1.00～2.00） 2.00（1.00～3.00） Z=-5.608 <0.001 PALBI评分 -2.00±0.46 -1.65±0.47 t=-5.629 <0.001 2.3 多因素Logistic回归模型分析
以单因素分析差异有统计学意义的指标为自变量，同时为避免多重共线性，采用相关性分析及计算方差膨胀因子，排除与PALBI评分、AIMS65评分具有共线性的变量，包括Alb、TBil、收缩压、INR、Cr、PT、CTP评分和MELD评分。以是否发生死亡为因变量，行Logistic回归分析，结果显示呕血、既往有静脉曲张病史、PALBI评分及AIMS65评分是影响肝硬化并发AUGIB患者短期死亡的独立危险因素（P值均<0.05）（表5）；进一步将PALBI评分和AIMS65评分纳入Logistic回归分析，建立肝硬化并发AUGIB患者生存预测模型：Logit（P）=-1.992+1.126×PALBI评分+ 1.462×AIMS65评分。
表 5 生存组及死亡组中的多因素分析Table 5. Multivariate analysis of survival group and death group变量 B值 SE Wald P值 OR 95%CI 呕血 1.469 0.428 11.782 <0.001 4.34 1.88～10.05 既往有静脉曲张 1.255 0.479 6.864 0.009 3.51 1.37～8.98 PALBI评分 1.501 0.568 6.992 0.008 4.49 1.48～13.64 AIMS65评分 1.348 0.251 28.793 <0.001 3.85 2.35～6.30 以是否发生再出血为因变量，行Logistic回归分析，结果显示PALBI评分和AIMS65评分是影响肝硬化并发AUGIB患者短期再出血的独立危险因素（P值均<0.05）（表6）；进一步将上述两项评分纳入Logistic回归分析，建立肝硬化合并AUGIB患者再出血预测模型：Logit（P）=0.278+0.945×PALBI评分+0.529×AIMS65评分。
表 6 未再出血组及再出血组中的多因素分析Table 6. Multivariate analysis of non-rebleeding group and rebleeding group变量 B值 SE Wald P值 OR 95%CI 呕血 0.609 0.315 3.732 0.053 1.84 0.99～3.41 糖尿病病史 -0.550 0.392 1.969 0.161 0.58 0.27～1.24 PALBI评分 0.880 0.368 5.728 0.017 2.41 1.17～4.95 AIMS65评分 0.458 0.156 8.635 0.003 1.58 1.17～2.15 2.4 ROC曲线分析
各评分预测6周内生存情况的ROC曲线结果显示，CTP评分、MELD评分、PALBI评分、AIMS65评分、PALBI联合AIMS65评分的AUC分别为0.758、0.798、0.789、0.870、0.888，其中PALBI联合AIMS65评分的AUC最大，高于4种评分单独预测（P值均<0.05）（表7，图1）。各评分预测6周内再出血的ROC曲线结果显示，CTP评分、MELD评分、PALBI评分、AIMS65评分、PALBI联合AIMS65评分的AUC分别为0.680、0.719、0.709、0.711、0.741，其中PALBI联合AIMS65评分的AUC高于4种评分单独预测（P值均<0.05），但特异度较低（表8，图2）。
表 7 四种评分系统单独及联合预测6周内死亡的ROC曲线结果Table 7. ROC curve results of death within 6 weeks predicted by four scoring systems alone and combined detection评分系统 AUC（95%CI） 敏感度（%） 特异度（%） 最佳截断值 P值 CTP评分 0.758（0.699～0.811）1） 64.62 78.03 8.00 <0.001 MELD评分 0.798（0.741～0.847）1） 80.00 69.94 8.53 <0.001 PALBI评分 0.789（0.732～0.839）1） 78.46 66.47 -1.83 <0.001 AIMS65评分 0.870（0.821～0.910）1） 69.23 90.75 2.00 <0.001 PALBI+AIMS65 0.888（0.841～0.925） 86.15 79.19 <0.001 注：与PALBI+AIMS65比较，1）P<0.05。 
图 1 各评分预测生存情况的ROC曲线Figure 1. ROC curve of the four scores for predicting death alone and combined detection
图 2 各评分预测再出血的ROC曲线Figure 2. ROC curve of rebleeding predicted by four scores alone and combined detection表 8 四种评分系统单独及联合预测6周内再出血的ROC曲线结果Table 8. ROC curve results of rebleeding within 6 weeks predicted by four scoring systems alone and combined detection评分系统 AUC（95%CI） 敏感度（%） 特异度（%） 最佳截断值 P值 CTP评分 0.680（0.617～0.739）1） 51.69 77.18 8.00 <0.001 MELD评分 0.719（0.658～0.776）1） 57.30 80.54 10.55 <0.001 PALBI评分 0.709（0.647～0.766）1） 67.42 67.11 -1.83 <0.001 AIMS65评分 0.711（0.649～0.768）1） 48.31 87.92 2.00 <0.001 PALBI+AIMS65 0.741（0.681～0.796） 70.79 71.14 <0.001 注：与PALBI+AIMS65比较，1）P<0.05。 3. 讨论
AUGIB是肝硬化的严重并发症，美国肝病学会指导意见［10］以及我国专家共识［11］明确提出6周内肝硬化患者的病死率可作为评估治疗效果的主要终点。我国《肝硬化门静脉高压食管胃静脉曲张出血的防治指南》［12］提出以6周为时间界限，定义出血控制后72 h～6周出现活动性出血为早期再出血，6周后为迟发性再出血。综上，6周内的再出血率和病死率可作为预测AUGIB患者预后情况的重点观测指标。此外，有超过60%的1～2年内有再出血情况的患者在出血有效控制后没有进一步行有效二级预防，且6周病死率达20%［13］，主要与肝、肾功能不全和细菌感染有关。所以肝硬化并发AUGIB患者早期使用风险分层评分十分重要，一方面利于制订个体化治疗方案，减少治疗费用；另一方面可有效提高患者的生存率，降低再出血率。
本研究共纳入238例患者，其中65例死亡，病死率27.3%。既往研究［4， 14］显示，肝硬化并发AUGIB患者的6周内病死率高达20%，死亡危险因素包括年龄增加、合并症（如呼吸或心功能不全、肾衰竭和败血症）、严重的血流动力学不稳定或进一步出血的发展等［15］。考虑本研究纳入患者中肝硬化病史时间较长以及既往有静脉曲张病史的人数较多，故病死率偏高。
本研究发现在死亡组与生存组中，呕血、既往有静脉曲张病史、Alb、TBil、INR、Cr、PT、收缩压等差异均有统计学意义（P值均<0.05）；多因素Logistic回归分析结果显示呕血、既往有静脉曲张病史、PALBI评分和AIMS65评分是肝硬化并发AUGIB患者短期内死亡的独立危险因素（P值均<0.05）。Li等［16］研究显示在非静脉曲张性AUGIB患者中，有呕血临床表现者较单纯有黑便但无呕血临床表现的患者病死率更高，与本研究结果一致。有研究［17］发现静脉曲张的严重程度是早期病死率相关的危险因素，30%～50%的肝硬化患者在首次静脉曲张出血发作后6周内死亡。肝硬化肝组织重塑引起的改变与肝内门静脉血流阻力增加有关，血液通过肝脏的侧支通路返回体循环，这些侧支通路的形成常导致急性静脉曲张破裂出血［14］。因此入院时有呕血临床表现、既往有静脉曲张病史是肝硬化AUGIB患者短期内死亡的重要预测因素［16］。进一步绘制ROC曲线显示PALBI评分联合AIMS65评分对肝硬化并发AUGIB患者入院后6周内的生存情况具有较高的预测价值（AUC=0.888），优于CTP评分及MELD评分。
再出血是肝硬化患者预后的另一重要结局，研究［18］显示肝硬化合并AUGIB患者早期（6周内）再出血率为30%～40%，本研究中患者再出血率为37.4%，与以上结果相符。本研究发现在再出血与未再出血组中，呕血、糖尿病病史、Alb、TBil、INR、Cr、PT等差异均有统计学意义（P值均<0.05）；多因素Logistic回归分析结果显示PALBI评分和AIMS65评分是肝硬化并发AUGIB患者短期内再出血的独立危险因素（P值均<0.05）。进一步绘制ROC曲线，结果显示PALBI评分联合AIMS65评分对肝硬化合并AUGIB患者入院后6周内再出血的预测价值较低（AUC=0.741），准确性一般。
PALBI评分由Roayaie等［19］在2015年提出，研究［20］表明该评分是一项简单、客观的指标，在预测既往有失代偿肝硬化AUGIB患者的病死率方面优于CTP及MELD评分。此外，PALBI评分是通过肝功能和门静脉高压指标计算得出的客观评分，不受腹水和脑病的影响［20］。然而该评分系统也存在局限性，其仅考虑了反映肝功能的Alb和TBil，HBsAg阳性、AST和ALT等因素被排除在外。Alb半衰期较短，且受临床治疗（补充Alb）的影响，故PALBI评分1级患者不一定具有良好的肝功能，而其他相关原因导致的PLT、Alb、TBil水平低下的患者，并不一定肝功能受损严重。
2020年澳大利亚的一项大型多中心研究［7］测试了出血风险评分系统AIMS65，发现其与验证过的上消化道出血风险评分和肝病严重程度评分在预测病死率的准确性方面作用等同。AIMS65评分包括年龄和收缩压等指标，能够识别预后较差的老年和休克的患者，由此可以增加该评分预测短期病死率的准确性。AIMS65评分计算简便，因此易于缺乏管理急性静脉曲张破裂出血经验的一线医生所使用，该评分在预测病死率和再出血风险方面优于CTP及MELD评分［7］。
综上所述，PALBI评分和AIMS65评分简单客观、易于获取、使用方便，有利于其在临床实践中应用。二者联合在预测短期病死率方面表现较好，而在预测再出血率方面欠佳。因此，肝硬化并发AUGIB患者早期入院时可应用PALBI评分联合AIMS65评分对病情严重程度进行评估，及时对患者进行诊治，改善预后。
本研究也有一些局限性。首先，作为一项单中心研究，缺乏来自多中心的数据可能会导致潜在的偏倚；其次，本研究为回顾性分析，患者在住院期间接受了不同的止血治疗，而不同的治疗方法可能会影响预后。
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图 2 SDS-PAGE电泳分析His-mhIFNAR2蛋白的表达
Figure 2. Expression of His-mhIFNAR2 analyzed by SDS-PAGE
注： L1，中分子量的蛋白质标准；L2，mhIFNAR2多抗血清作为一抗（1∶1 000）；L3，mhIFNAR2多抗血清作为一抗（1∶10 000）；L4，正常小鼠血清作为一抗；L5，兔抗His作为一抗。
图 4 纯化的目的蛋白Western Blot检测
Figure 4. Western Blot analysis of the activity and specificity of antisera
图 5 mhIFNAR2多克隆抗体的免疫组化结果（DAB，×400）
Figure 5. Immunohistochemical of mhIFNAR2 polyclonal antibodies（DAB，×400）
图 6 PBMC中mhIFNAR2免疫荧光检测
Figure 6. Stained with mouse anti-mhIFNAR2 antibody by immunofluorescence in PBMC
图 7 不同浓度的siRNA840对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用
Figure 7. The inhibitory effect of siRNA840 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A
表 1 干扰素受体β亚基的引物序列
Table 1. Primer sequences for interferon receptor β subunit
名称 序列 核苷酸 位点 mhIFNAR1-2s 5′-AGTACATTTAGAAGCTGAAG-3' 396～416 mhIFNAR1-2as 5'-CTCTTCAGACCAAAAAGATG-3' 943～963 mhIFNAR2-1s 5'-CCATCTTATCATGGGAATTA-3' 149～169 mhIFNAR2-1as 5'-CTCTCAAAAACACAGAGTT-3' 1 281～1 300 
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表 2 mhIFNAR2 siRNA 模板序列
Table 2. Template of mhIFNAR2 siRNA
cDNA 正义链（5′-3′） 反义链（3′-5′） GAAGTAGCTCTCAGAACTA（mhIFNAR1B840B） GAAGUAGCUCUCAGAACUAdTdT dTdTCUUCAUCGAGAGUCUUGAU GCTTTACAGACCACATTAA（mhIFNAR2B277B） GCUUUACAGACCACAUUAAdTdT dTdTCGAAAUGUCUGGUGUAAUU GCTGAAGATAAGGCAATAA（mhIFNAR1B412B） GCUGAAGAUAAGGCAAUAAdTdT dTdTCGACUUCUAUUCCGUUAUU 阴性对照 公司未提供序列
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表 3 EMCV感染滴度测定结果
Table 3. Result of EMCV infection titer determination
病毒稀释 有CPE孔 无CPE孔 累计有CPE孔 累计无CPE孔 有/总和 感染百分率（%） 100 4 0 39 0 39/39 100 10-1 4 0 35 0 35/35 100 10-2 4 0 31 0 31/31 100 10-3 4 0 27 0 27/27 100 10-4 4 0 23 0 23/23 100 10-5 4 0 19 0 19/19 100 10-6 4 0 15 0 15/15 100 10-7 4 0 11 0 11/11 100 10-8 4 0 7 0 7/7 100 10-9 2 2 3 2 3/5 60 10-10 1 3 1 5 1/6 16.7
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表 4 不同浓度的siRNA277对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用
Table 4. The inhibitory effect of siRNA277 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A
组别 mhIFNAR2 M×A 空白对照（n=3） 11.678±0.725 3.087±1.910 阴性对照（n=3） 14.190±3.100 4.150±0.500 20 nmol/L（n=3） 2.538±0.1241）2） 1.350±0.2121）2） 注：与空白对照组比较，1）P<0.05；与阴性对照组比较，（2）P<0.05。
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