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扶正化瘀方对肝硬化小鼠模型肝细胞消亡与再生的影响
DOI: 10.12449/JCH240417
Effect of Fuzheng Huayu prescription on hepatocyte extinction and regeneration in a mouse model of liver cirrhosis
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摘要:
目的 探讨扶正化瘀方对纤维化肝脏肝细胞消亡与再生的影响，及其药物促进肝细胞再生的作用机制。 方法 以CCl4腹腔注射6周诱导建立肝硬化小鼠模型。正常对照组9只，模型组10只，索拉非尼组10只，扶正化瘀方组10只。自造模第4周起，扶正化瘀方组、索拉非尼组分别给予4.8 g/kg、4 mg/kg小鼠体质量相应药物灌胃，连续3周；正常组和模型组给予等体积羧甲基纤维素钠。检测血清肝功能；METAVIR评分系统评价肝组织炎症及纤维化分期；天狼星红染色和肝组织羟脯氨酸含量评价胶原沉积量；免疫组化检测Ⅳ型胶原、CD31与CD32b、Ki67、CyclinD1、谷氨酰胺合成酶（GS）、Wnt2以及HGF蛋白的表达；Western Blot检测肝组织Wnt2、LRP6、β-catenin、p-β-catenin、CyclinD1表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与模型组比较，扶正化瘀方组和索拉非尼组血清ALT、AST水平和肝组织羟脯氨酸含量均降低（P值均<0.01），METAVIR评分减低（P值均<0.05）；Ⅳ型胶原、CD31表达减少（P值均<0.05），CD32b表达增加（P<0.01）；肝组织实质病变消亡数量减少，Ki67、CyclinD1表达上升（P值均<0.01）；Wnt2、LRP6、β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平上调、p-β-catenin表达显著下调（P值均<0.05）；肝组织CD32b与Wnt2共染阳性细胞显著增多。 结论 扶正化瘀方可通过抑制肝窦毛细血管化，改善肝窦内皮细胞Wnt2外分泌功能，激活肝细胞再生相关Wnt/β-catenin信号通路，最终逆转肝硬化。 Abstract:Objective To investigate the effect of Fuzheng Huayu prescription on hepatocyte extinction and regeneration in fibrotic liver and its mechanism of action in promoting hepatocyte regeneration. Methods Mice were given intraperitoneal injection of CCl4 for 6 weeks to establish a model of liver cirrhosis， and there were 10 mice in the model group， 10 in the sorafenib group， 10 in the Fuzheng Huayu prescription group， and 9 in the normal control group. Since week 4 of modeling， the mice in the Fuzheng Huayu prescription group and the sorafenib group were given the corresponding drug by gavage at a dose of 4.8 g/kg and 4 mg/kg， respectively， for three consecutive weeks， and those in the normal group and the model group were given an equal volume of sodium carboxymethyl cellulose. Serum liver function parameters were measured； the METAVIR scoring system was used to evaluate liver inflammation and fibrosis stage； Sirius Red staining and hydroxyproline （Hyp） content in liver tissue were used to evaluate collagen deposition； immunohistochemistry was used to measure the protein expression levels of type IV collagen， CD31， CD32b， Ki67， CyclinD1， glutamine synthetase， Wnt2， and HGF， and Western blot was used to measure the expression levels of Wnt2， LRP6， β-catenin， p-β-catenin， and CyclinD1 in liver tissue. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the model group， the Fuzheng Huayu prescription group and the sorafenib group showed the following changes： significant reductions in the serum levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase and the content of Hyp in liver tissue （all P<0.01）； a significant reduction in METAVIR score； significant reductions in the expression levels of type Ⅳ collagen and CD31 （all P<0.05） and a significant increase in the expression level of CD32b （P<0.01）； significant reductions in the number of parenchymal extinction lesions and significant increases in the expression levels of Ki67 and CyclinD1 in liver tissue （all P<0.01）； significant increases in the protein expression levels of Wnt2， LRP6， β-catenin， and CyclinD1 and a significant reduction in the protein expression level of p-β-catenin （all P<0.05）； significant increases in the number of cells stained positive for both CD32b and Wnt2. Conclusion Fuzheng Huayu prescription can inhibit hepatic sinusoidal capillarization， improve the Wnt2 exocrine function of liver sinusoidal endothelial cells， activate the Wnt/β-catenin signaling pathway associated with hepatocyte regeneration， and finally reverse liver cirrhosis. -
Key words:
- Liver Cirrhosis /
- Liver Regeneration /
- Fuzheng Huayu Recipe
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慢性肝病进展可导致肝硬化，形成以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理改变，在代偿期可无明显临床症状，进一步发展至失代偿期可导致门静脉高压和严重的肝损伤［1］。抗肝纤维化是慢性肝病包括肝硬化的中药治疗措施，但是目前除了病因治疗，尚缺乏针对肝细胞外基质代谢的药物［2-3］，这提示需要从其他角度尝试逆转治疗肝纤维化与肝硬化。近年有研究［4］表明，减少肝细胞消亡与增加肝细胞再生可促进肝纤维化逆转，但抗肝纤维化中药的作用机制是否与肝细胞消亡再生相关尚不清楚。
扶正化瘀方（FZHY）由丹参、虫草菌丝、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子6味中药组成，基础和临床研究发现该方具有抗肝纤维化的作用［5］。既往研究［6-9］表明，扶正化瘀方可以抑制肝星状细胞活化、减轻肝组织炎症损伤、减少细胞外基质沉积、抑制血管生成等，但对纤维化发展过程中能否改善肝实质细胞消亡的作用较少探及。因此，本实验拟观察扶正化瘀方对肝纤维化中肝细胞消亡与再生的影响，并探讨药物影响肝细胞再生的作用机制，以期更进一步了解扶正化瘀方影响肝细胞的抗肝纤维化作用机制。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
6周龄C57BL/6雄性小鼠39只，SPF级，购自北京维通利华实验动物中心，实验动物生产许可证编号：SCXK（沪）2022-0007。实验小鼠饲养于上海中医药大学动物实验中心，19 ℃～22 ℃、相对湿度50%～60%环境，自由进食和饮水。实验动物使用许可证编号：SYXK（沪）2020-0009。
1.1.2 药物与试剂
扶正化瘀方由上海现代中医药技术发展公司提供（批准号：Z20050546），其组成、浸膏粉提取方法参见文献［10］报道。索拉非尼，购自南京凌帝仁化工科技有限公司。无毒环保苏木素染液（货号：D005-1-3）、伊红染液（货号：D019-1-3），购自南京建成生物工程研究所有限公司。生化检测用ALT试剂盒（货号：C009-2-1）、AST试剂盒（货号：C010-2-1），购自南京建成生物工程研究所。谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）（货号：ab176562）、CD32b（货号：ab45143）、CyclinD1（货号：Ab134175）购自Abcam；CD31（货号：77699S）、Ki67（货号：12202T）、p-β-Catenin（货号：9561）抗体购自CST；LRP6（货号：A6134）、Wnt2（货号：A5864）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）（货号：A1193）抗体购自ABclonal；Alb（货号：16475-1-AP）、β-catenin（货号：51067-2-AP）购自Proteintech；多重免疫组化试剂盒（货号：10001100020），购自百诺全景。。
1.1.3 主要仪器
BT223S电子分析天平购自德国赛多利斯集团（sartorius）；微孔板分光光度计购自美国伯腾仪器有限公司（BioTek）；CM1850冰冻切片机、ASP300全自动组织脱水机、SCN400数字扫描切片机、ImageScope图像分析软件均购自德国莱卡公司（Leica）；Olympus IX70倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司（Olympus）；微波炉，购自广东美的集团股份有限公司（Galanz）；Odyssey红外荧光扫描成像系统购自美国LI-COR Biosciences公司；多光谱成像系统Vectra购自Akoya Biosciences公司。
1.2 实验方法
1.2.1 CCl4诱导肝硬化小鼠模型制备及分组
实验小鼠适应性饲养1周，按随机数表法分为正常组（N组，n=9）、模型组（M组，n=10）、索拉非尼组（S组，n=10）、扶正化瘀方组（F组，n=10），共4组。以15% CCl4橄榄油腹腔注射，2 mL/kg，3次/周，连续6周诱导小鼠早期肝硬化模型，正常组小鼠腹腔注射等剂量橄榄油。自造模第4周起，扶正化瘀方组、索拉非尼组分别给予4.8 g/kg、4 mg/kg小鼠体质量相应药物灌胃，1次/d，连续3周；正常组和模型组小鼠以等体积的0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。
1.2.2 血清肝功能检测
血清ALT、AST均按试剂盒说明书检测。
1.2.3 肝组织病理染色
小鼠肝组织10%甲醛浸泡固定、脱水后石蜡包埋，5 μm厚度切片；进行HE染色、天狼星红染色，用Leica扫描仪扫描全片，采用METAVIR评分方法进行肝纤维化分期，并使用ImageScope软件进行胶原半定量分析。
1.2.4 肝组织免疫组化染色
石蜡切片于60 ℃烤片机上烘烤40 min。脱蜡水化后切片浸泡在0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）或者Tris-EDTA缓冲液中进行抗原修复，3%过氧化氢-甲醇孵育15 min，消除内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭20 min后滴加适量一抗，37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育过夜，二抗在室温孵育1 h，DAB显色。苏木素染核后盐酸酒精分化，逐级乙醇脱水透明，中性树胶封片。使用Leica扫描仪扫描全片，并使用ImageScope软件进行半定量分析。
1.2.5 多重荧光免疫组化技术
从脱蜡至抗体孵育同免疫组化染色步骤，增加TSA室温孵育10 min，TBST漂洗后进行抗原修复，使用柠檬酸钠缓冲液或者Tris-EDTA缓冲液中煮沸维持15 min，冷却至室温后，继续进行下一个一抗的孵育，重复从抗原修复到TSA孵育的步骤直至染色完成。DAPI室温孵育后漂洗封片。多光谱成像系统Vectra®拍摄，并用配套inForm识别软件进行成像分析。
1.2.6 肝组织羟脯氨酸含量测定
按照Jamall氏法［11］检测小鼠肝脏羟脯氨酸含量，以盐酸水解法测定。
1.2.7 Western Blot检测
取约100 mg肝组织，加入1 mL含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、0.1 mol/L PMSF的RIPA裂解液，组织研磨仪研磨提取蛋白，根据ThermoFisher Scientific BCA试剂盒说明书进行蛋白定量，98 ℃金属浴10 min变性蛋白。每孔上样量为20 μg蛋白，电泳条件为80 V、2.5 h。使用PVDF膜转膜后室温封闭30 min，加入一抗置4 ℃冰箱过夜，二抗室温孵育1 h，使用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描，并使用Image J软件进行灰度值分析。
1.2.8 肝细胞消亡程度评估
首先对肝组织进行GS免疫组化染色，中央静脉周围正常肝细胞均呈GS+，因此可以通过GS来定位中央静脉的位置。由于生理情况下中央静脉距汇管区较远，而炎症坏死出现肝实质细胞消亡病变（parenchymal extinction lesions，PEL）时，中央静脉与汇管区距离变近；因此可通过靠近中央静脉的汇管区数量来计算PEL数量，通过中央静脉与汇管区的距离反应PEL的程度［12-13］。
1.3 统计学方法
采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，使用GraphPad Prism 9软件绘制结果图。计量资料用
2. 结果
2.1 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型血清学肝功能的影响
在血清ALT水平上，正常组为（25.59±5.90）U/L，模型组为（288.72±38.84）U/L，扶正化瘀方组和索拉非尼组分别为（162.39±56.35）U/L、（218.57±40.80）U/L，相较于正常组，模型组ALT明显升高（P<0.01）；与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组和索拉非尼组小鼠ALT均明显降低（P值均<0.01）。
在血清AST水平上，正常组为（9.73±6.35）U/L，模型组为（44.50±7.66）U/L，扶正化瘀方组和索拉非尼组分别为（15.49±4.53）U/L、（18.68±7.25）U/L，相较于正常组，模型组AST明显升高（P<0.01）；与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组和索拉非尼组小鼠AST均明显降低（P值均<0.01）。
2.2 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠肝组织炎症、胶原沉积的影响
肝组织HE和天狼星红染色结果显示，正常组小鼠肝小叶完整，无明显炎性细胞浸润及坏死，无明显胶原沉积；与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝组织大量炎性细胞浸润，肝板结构被破坏，汇管区与肝小叶内大量纤维胶原沉积，假小叶形成。与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组与索拉非尼组小鼠肝组织炎症、胶原沉积明显减轻（图1）。其中模型组纤维化评分为3.00±0.67，索拉非尼组纤维化评分下降为2.30±0.48（P<0.05），扶正化瘀方组纤维化评分下降为2.10±0.57（P<0.01）。
图 1 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织炎症、胶原沉积的影响（×100）Figure 1. Effect of FZHY on liver inflammation， collagen deposition in CCl4 mice （×100）与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝组织羟脯氨酸含量显著增加（P<0.01），升高比例达60%，与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组和索拉非尼组羟脯氨酸含量均明显降低（P值均<0.05）（图2）。
图 2 扶正化瘀方对肝组织羟脯氨酸含量的影响Figure 2. Effect of FZHY on hydroxyproline content in liver tissue2.3 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠肝窦毛细血管化的影响
免疫组化结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肝组织基底膜主要成分Ⅳ型胶原、血管标志物CD31阳性表达增加，肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）CD32b明显减少（P<0.01），与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组和索拉非尼组Ⅳ型胶原、CD31阳性表达均较模型组明显减少，CD32b阳性表达增加（P值均<0.01）（图3、4）。
图 3 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ⅳ型胶原、CD31、CD32b表达的影响Figure 3. Effect of FZHY on the expression of collagen type Ⅳ， CD31 and CD32b in CCl4 mice
图 4 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ⅳ型胶原、CD31、CD32b的影响（×200）Figure 4. Effect of FZHY on the collagen type Ⅳ， CD31 and CD32b in CCl4 mice （×200）2.4 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠PEL程度的影响
模型组小鼠肝细胞GS表达分布于纤维间隔及汇管区，PEL数量增加。在PEL数量上，正常组为（2.00±0.82）个，模型组为（8.00±1.63）个，扶正化瘀组为（2.33±0.47）个，索拉非尼组为（2.67±0.67）个，与正常组比较，模型组PEL数量明显增多（P<0.01），较之于模型组，扶正化瘀方组和索拉非尼组PEL数量均显著减少（P值均<0.01）。在中央静脉与汇管区的距离上，正常组为（321.30±18.00）μm，模型组为（36.25±14.16）μm，扶正化瘀方组为（236.49±34.43）μm，索拉非尼组为（190.07±13.96）μm，与正常组比较，模型组距离明显缩短（P<0.01），较之于模型组，扶正化瘀方组和索拉非尼组距离显著增长（P值均<0.01）（图5、6）。
图 5 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织PEL程度的影响（GS免疫组化染色）Figure 5. Effect of FZHY on PEL in CCl4 mice （GS immunohistochemical staining）
图 6 扶正化瘀方对肝组织PEL数量和对肝组织中央静脉与汇管区距离的影响Figure 6. Effect of FZHY on PEL number and distance between central vein and portal area of liver tissue2.5 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠肝细胞增殖的影响
与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠肝细胞Ki67和HGF阳性表达均减少（P值均<0.05），少量阳性着色分布于纤维间隔及小叶内，与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组及索拉非尼组肝细胞Ki67表达明显增多（P值均<0.01），广泛分布在肝组织切片视野，HGF的表达较模型组均明显增多（P值均<0.01）（图7、8）。
图 7 扶正化瘀方对肝组织Ki67和HGF表达的影响Figure 7. Effect of FZHY on the expression of Ki67 and HGF in CCl4 mice
图 8 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ki67和HGF的影响（×200）Figure 8. Effect of FZHY on Ki67 and HGF in CCl4 mice （×200）2.6 扶正化瘀方对模型小鼠LSEC中CD32b与Wnt2表达的影响
CD32b与Wnt2共染结果显示，模型组CD32b+Wnt2+的LSEC较正常组显著减少，扶正化瘀方组和索拉非尼组CD32b+Wnt2+细胞显著增加。提示使用扶正化瘀方后LSEC外分泌Wnt2的功能改善（图9）。
注： CD32b，黄色；Wnt2，红色；DAPI：蓝色。图 9 扶正化瘀方对模型小鼠LSEC中CD32b与Wnt2表达的影响（×200）Figure 9. Effect of FZHY on the expression of CD32b and Wnt2 in mice（×200）2.7 扶正化瘀方促进模型小鼠肝细胞再生与LSEC的Wnt2激活肝细胞Wnt/β-catenin信号通路有关
免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肝组织Wnt2、CyclinD1阳性表达均明显减少（P值均<0.05）；与模型组小鼠相比，扶正化瘀方组和索拉非尼组Wnt2、CyclinD1的表达均明显增多（P值均<0.01）（图10、11）。
图 10 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响（×200）Figure 10. Effect of FZHY on Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein in CCl4 mice（×200）
图 11 扶正化瘀方对Wnt2和CyclinD1表达的影响Figure 11. Effect of FZHY on the expression of Wnt2 and CyclinD1 in CCl4 miceWestern Blot结果显示：与正常组相比，模型组肝组织LRP6、β-catenin表达无明显差异（P值均>0.05），Wnt2、CyclinD1表达下降（P值均<0.05），p-β-catenin表达明显升高（P<0.05）；与模型组相比，扶正化瘀方组、索拉非尼组Wnt2、LRP6、β-catenin、CyclinD1的表达均呈现不同程度的升高（P值均<0.05），p-β-catenin的表达显著下降（P值均<0.05）（图12）。
图 12 扶正化瘀方对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响Figure 12. Effect of FZHY on Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein in CCl4 mice3. 讨论
PEL是不同病因慢性肝病进展过程中的必经阶段：肝细胞在各种致病因素的刺激下，出现损伤甚至坏死，造成局部组织坍陷，随后塌陷区域逐渐由胶原纤维代替，并最终发展成肝硬化。PEL是肝窦消失的结构性改变，其内涵包括肝细胞死亡、网状纤维坍陷以及LSEC脱失［14］。PEL不仅反映了实质细胞炎症坏死的程度，同时还反映了血管重塑的程度。当发生PEL后，由于紧缩网状纤维的牵拉以及肝血窦固有血流通路的消失，使得门管区与中央静脉两者被动地相互靠近，甚至出现融合［11］，并形成动静脉短路［15］。既往研究［16-18］表明，祛除病因后可以缓解患者的肝纤维化程度；但在肝硬化背景下，单纯病因治疗并不能完全逆转疾病进程。这是由于PEL形成中伴随着血管网改建，使得即便纤维化消退后，畸变的血管网仍会维持缺氧促炎的内环境，成为独立推动疾病进程的内在因素［11］。因此病因治疗基础上降低PEL、促进肝实质细胞的再生是肝硬化治疗的关键。
LSEC是肝脏最先感受损伤变化的细胞，且LSEC的外分泌作用可促进肝细胞的增殖［19］，或可以此发现缓解PEL的方法。目前研究［19］表明，慢性肝病过程中，LSEC外分泌的Wnt2对维持肝细胞再生、抑制肝细胞消亡具有作用，其机制与Wnt/β-catenin信号通路有关。目前该信号的转导已确定为肝脏再生的主要贡献者［20］。而LSEC可释放特定的Wnt配体，结合肝细胞上Wnt受体蛋白，激活完整的信号转导，促进CyclinD1等靶基因上调，推动肝细胞进入细胞分裂周期［21-22］。
为了进一步研究中药对上述生物学过程中PEL的影响，本研究选择了具有明确抑制肝窦毛细血管增生效果的索拉非尼作为阳性对照药物。实验结果表明：扶正化瘀方与索拉非尼均可显著可通过抑制肝窦毛细血管化，恢复LSEC正常CD32b表型、增加Wnt2表达，并激活模型鼠肝细胞Wnt信号通路相关受体蛋白，增加肝细胞内CyclinD1的表达水平，促进肝细胞再生、降低PEL，最终逆转肝硬化；且两者疗效相当。
扶正化瘀方具有良好的抗肝纤维化循证医学证据，是我国行业指南的推荐药物［23］。笔者［9］发现：扶正化瘀方可促进实验性肝窦毛细血管化的逆转、保护内皮细胞损伤。网络药理学筛选发现“化瘀药”中丹参桃仁的主要作用在于调节Notch与Wnt等信号通路，介于激活Notch信号通路是LSEC丧失外分泌功能的主要分子机制、激活Wnt信号通路是肝再生的重要分子机制；笔者推测“化瘀药”对促进肝细胞再生修复、改善微循环的作用更佳［24］，但其具体的分子信号机制有待进一步探讨。
总之，扶正化瘀方可减少肝细胞消亡、促进肝细胞再生、逆转肝硬化，其机制可能在于影响肝窦内皮细胞外分泌Wnt2功能，激活Wnt/β-catenin信号通路。
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图 1 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织炎症、胶原沉积的影响（×100）
Figure 1. Effect of FZHY on liver inflammation， collagen deposition in CCl4 mice （×100）
图 2 扶正化瘀方对肝组织羟脯氨酸含量的影响
Figure 2. Effect of FZHY on hydroxyproline content in liver tissue
图 3 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ⅳ型胶原、CD31、CD32b表达的影响
Figure 3. Effect of FZHY on the expression of collagen type Ⅳ， CD31 and CD32b in CCl4 mice
图 4 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ⅳ型胶原、CD31、CD32b的影响（×200）
Figure 4. Effect of FZHY on the collagen type Ⅳ， CD31 and CD32b in CCl4 mice （×200）
图 5 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织PEL程度的影响（GS免疫组化染色）
Figure 5. Effect of FZHY on PEL in CCl4 mice （GS immunohistochemical staining）
图 6 扶正化瘀方对肝组织PEL数量和对肝组织中央静脉与汇管区距离的影响
Figure 6. Effect of FZHY on PEL number and distance between central vein and portal area of liver tissue
图 7 扶正化瘀方对肝组织Ki67和HGF表达的影响
Figure 7. Effect of FZHY on the expression of Ki67 and HGF in CCl4 mice
图 8 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型肝组织Ki67和HGF的影响（×200）
Figure 8. Effect of FZHY on Ki67 and HGF in CCl4 mice （×200）
注： CD32b，黄色；Wnt2，红色；DAPI：蓝色。
图 9 扶正化瘀方对模型小鼠LSEC中CD32b与Wnt2表达的影响（×200）
Figure 9. Effect of FZHY on the expression of CD32b and Wnt2 in mice（×200）
图 10 扶正化瘀方对CCl4肝硬化小鼠模型Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响（×200）
Figure 10. Effect of FZHY on Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein in CCl4 mice（×200）
图 11 扶正化瘀方对Wnt2和CyclinD1表达的影响
Figure 11. Effect of FZHY on the expression of Wnt2 and CyclinD1 in CCl4 mice
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