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间充质干细胞联合免疫抑制剂对肝移植大鼠模型免疫排斥的影响

李海涛 俞赛花 陈丽红 赖子森 刘海岩 刘红枝 沈聪龙

李海涛, 俞赛花, 陈丽红, 等 . 间充质干细胞联合免疫抑制剂对肝移植大鼠模型免疫排斥的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(6): 1209-1214. DOI: 10.12449/JCH240622.
引用本文: 李海涛, 俞赛花, 陈丽红, 等 . 间充质干细胞联合免疫抑制剂对肝移植大鼠模型免疫排斥的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2024, 40(6): 1209-1214. DOI: 10.12449/JCH240622.
LI HT, YU SH, CHEN LH, et al. Effect of mesenchymal stem cells combined with immunosuppressants on immune rejection in a rat model of liver transplantation[J].J Clin Hepatol, 2024, 40(6): 1209-1214. DOI: 10.12449/JCH240622.
Citation: LI HT, YU SH, CHEN LH, et al. Effect of mesenchymal stem cells combined with immunosuppressants on immune rejection in a rat model of liver transplantation[J].J Clin Hepatol, 2024, 40(6): 1209-1214. DOI: 10.12449/JCH240622.

间充质干细胞联合免疫抑制剂对肝移植大鼠模型免疫排斥的影响

DOI: 10.12449/JCH240622
基金项目: 

福建省自然科学基金 (2020J011163);

福建省卫生健康委医学创新项目 (2020CXA054);

福州市临床重点专科建设项目 (20230101)

伦理学声明: 本研究方案于2023年5月25日经由福建医科大学孟超肝胆医院实验动物伦理委员会审批,批号:MCHH-AEC-2023-04,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:李海涛负责设计论文框架,起草论文;俞赛花、刘海岩负责实验操作,研究过程的实施;陈丽红、赖子森、刘红枝、沈聪龙负责数据收集,统计学分析。
详细信息
    通信作者:

    李海涛, lht45182@163.com (ORCID: 0000-0003-4680-4752)

Effect of mesenchymal stem cells combined with immunosuppressants on immune rejection in a rat model of liver transplantation

Research funding: 

The Natural Science Foundation of Fujian Province (2020J011163);

The Medical Innovation Project of Fujian Province (2020CXA054);

Key Clinical Specialty Discipline Construction Program of Fuzhou (20230101)

More Information
    Corresponding author: LI Haitao, lht45182@163.com (ORCID: 0000-0003-4680-4752)
  • 摘要:   目的  探讨间充质干细胞(MSC)联合免疫抑制剂(IS)对肝移植大鼠模型免疫排斥反应的影响。  方法  将F344大鼠分成5组:Normal组(不进行任何干预)、PS组(注射等量生理盐水)、MSC组(注射MSC)、IS组(注射IS)、MSC+IS组(注射MSC和IS),每组8只。除Normal组以外,各组均采用Kamada双袖套法不重建肝动脉建立原位肝移植模型。大鼠肝组织进行HE染色、Masson染色并进行纤维化程度统计,免疫组化实验检测T淋巴细胞和NK细胞浸润情况,免疫荧光实验分析巨噬细胞M2极化情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线,生存分析采用Log-rank检验。  结果  与PS组相比,MSC+IS组生存期显著延长(P<0.01),MSC组、IS组和MSC+IS组的肝组织结构明显改善,纤维化程度显著降低(P值均<0.000 1),NK细胞和T淋巴细胞浸润数量显著减少(P值均<0.000 1),巨噬细胞M2极化程度显著增加(P值均<0.000 1),提示MSC+IS组的疗效显著优于MSC组和IS组。  结论  MSC联合IS可以改善大鼠肝移植术后肝组织病理,降低炎性细胞浸润,促进巨噬细胞M2极化,起免疫抑制作用。

     

  • 肝移植是治疗终末期肝病的有效疗法,免疫排斥是限制肝移植发展的重要因素1-2。肝移植术后常用的免疫抑制剂(immunosuppressive,IS)包括:钙调磷酸酶抑制剂、霉酚酸酯、雷帕霉素、糖皮质激素等,长期使用这些药物存在较多不良反应3-5。因此,肝移植术后免疫抑制治疗的研究方向是寻找新型药物,在抑制免疫排斥和降低IS毒副作用之间取得平衡。

    间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节免疫等作用,被认为是肝病治疗的理想药物6-9。本研究建立原位肝移植大鼠模型,探讨单用MSC、单用IS、MSC联合IS抑制大鼠肝移植免疫排斥反应的效果,为进一步研究MSC在大鼠肝移植中的应用奠定基础。

    3周龄清洁级雄性F344大鼠,体质量50~70 g,用来提取MSC;8周龄清洁级雄性F344大鼠,体质量260~270 g,为肝移植供体;8周龄清洁级雄性Lewis大鼠,体质量275~285 g,为肝移植受体。以上实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证编号:SCXK(京)2019-0008,实验动物使用许可证编号:SYXK(闽)2022-0003。

    α-MEM培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(美国Gibco公司);双抗(美国Gibco公司);0.25%胰酶(美国Gibco公司);苏木素伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝公司);Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝公司);CD3抗体(武汉赛维尔公司);CD56抗体(武汉赛维尔公司)。

    1.3.1   MSC的体外分离、培养和鉴定

    将3周龄F344大鼠处死,无菌分离双下肢骨,用α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔,移入培养瓶中,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱培养。2 h后吸取上清,继续培养,去除快速贴壁细胞。24 h后更换培养基,去除不贴壁细胞。以后每隔2 d更换培养基,直至细胞融合度达到90%,用0.25%胰酶消化,传代培养。后续实验均使用P3代细胞。

    将P3代细胞消化、重悬,PBS清洗2次,使用5%BSA孵育20 min,PBS清洗2次,分别加入含CD44、CD105、CD34、CD31的0.5% BSA,室温避光孵育30 min,PBS清洗2次,上机检测。

    1.3.2   大鼠肝移植模型建立与分组

    采用Kamada双袖套法,不重建肝动脉10。F344大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,其中供体体质量略小于受体。各组手术无肝期为13~15 min,总时间为100~120 min,差异无统计学意义。术后大鼠单笼喂养,自由饮水、进食。

    实验分为5组,每组8只大鼠。Normal组:正常大鼠,即不进行任何干预的正常大鼠;其余组均进行大鼠原位肝移植,PS组注射生理盐水;MSC组注射MSC(分别在术前7 d、手术当天、术后7 d、术后15 d注射,每次每只大鼠注射3×106 MSC);IS组注射IS(氢化可的松0.75 mg·kg-1·d-1、环孢霉素1 mg·kg-1·d-1),MSC+IS组注射MSC和IS。

    1.3.3   病理切片染色

    取肝移植术后15 d肝组织,用4%多聚甲醛室温固定24 h,石蜡包埋,切片。分别使用苏木素伊红(HE)染色试剂盒和Masson染色试剂盒染色,封片镜检。Masson染色结果使用Image J软件量化。

    1.3.4   免疫组化

    取肝移植术后15 d肝组织,用4%多聚甲醛室温固定24 h,石蜡包埋,切片。切片常规脱蜡至水,EDTA抗原修复,3%的双氧水处理,血清封闭,一抗4 ℃过夜孵育,二抗室温孵育30 min,DAB显色,苏木素染核,封片镜检,阳性细胞数使用Image J软件量化。

    1.3.5   免疫荧光

    取肝移植术后15 d肝组织,用4%多聚甲醛室温固定24 h,石蜡包埋,切片。切片常规脱蜡至水,EDTA抗原修复,血清封闭,一抗4 ℃过夜孵育,二抗室温孵育2 h,DAPI染核,封片镜检,共定位细胞占比使用Image J软件量化。

    采用GraphPad Prism 9.5进行数据分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线,生存分析采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    原代培养2 d时细胞呈梭形,细胞轮廓清晰(图1)。原代培养10 d左右细胞融合度达到90%,传代后生长良好,杂细胞减少。利用流式细胞仪检测MSC的表面标志物,结果显示P3代细胞的纯度高,细胞表面抗原CD44、CD105、CD34、CD31的阳性率分别为97.7%、94.3%、2.02%、1.55%(图2)。

    图  1  MSC的外形鉴定(×20)
    Figure  1.  Shape identification of MSC(×20)
    图  2  MSC的表型鉴定
    Figure  2.  Phenotypic identification of MSC

    每组各留5只大鼠观察生存期,共观察60 d。其中Normal组无死亡,PS组在术后20 d之内全部死亡,MSC组和IS组在观察结束时均存活2只,MSC+IS组在观察结束时仅1只死亡(图3)。与Normal组相比,PS组大鼠生存期显著缩短(P<0.001)。与PS组相比,MSC+IS组大鼠生存期显著延长(P<0.05)。其余组别之间均无统计学差异(P值均>0.05)。

    图  3  大鼠肝移植后Kaplan-Meier生存曲线
    Figure  3.  Kaplan-Meier survival curve after liver transplantation in rats

    肝移植术后第15天,各组大鼠均发生不同程度的排斥反应。HE染色结果(图4)显示:PS组汇管区大量炎症细胞浸润,肝窦结构紊乱,静脉内皮炎症明显,大部分胆管结构不完整,炎症累及周围肝实质;MSC组和IS组部分汇管区可见炎症细胞浸润;MSC+IS组几乎没有汇管区存在炎症细胞浸润,其肝组织结构接近于Noraml组。4组相比较,PS组排斥反应程度最高,MSC组和IS组程度相似,MSC+IS组排斥程度最低。根据Masson染色结果(图45)可知:PS组纤维化程度最高(15.46±0.79)%,MSC+IS组程度最低(3.60±0.54)%。与Normal组相比,PS组纤维化程度显著升高(P<0.000 1)。与PS组相比,MSC组、IS组和MSC+IS组纤维化程度均显著降低(P值均<0.000 1)。MSC+IS组纤维化程度显著低于MSC组和IS组(P值均<0.000 1)。

    图  4  各组大鼠肝组织病理切片
    Figure  4.  Histopathological sections of rat liver in various groups
    图  5  大鼠肝移植术后肝组织纤维化程度统计图
    Figure  5.  Statistical graph of the degree of fibrosis in liver tissue after liver transplantation in rats

    选择CD56和CD3两个指标进行免疫组化染色,观察大鼠肝组织T淋巴细胞和NK细胞的浸润情况。T淋巴细胞和NK细胞都主要分布在汇管区,个别T淋巴细胞浸润到肝实质(图6a)。统计结果如图所示(图6b、c),PS组中T淋巴细胞和NK细胞浸润最严重,MSC+IS组浸润程度最低。与Normal组相比,PS组T淋巴细胞和NK细胞浸润程度显著升高(P<0.000 1)。与PS组相比,MSC组、IS组和MSC+IS组T淋巴细胞与NK细胞浸润程度显著降低(P值均<0.000 1)。

    注: a,免疫组化染色(×40);b、c,CD56、CD3阳性细胞占比统计结果。
    图  6  各组大鼠肝组织CD56、CD3指标免疫组化染色
    Figure  6.  Immunohistochemical staining of rat liver tissue for CD56 and CD3 indicators in each group

    CD68(巨噬细胞标志物)和CD163(巨噬细胞M2极化相关标志物)双重免疫荧光染色结果显示,与Normal组相比,PS组中CD68和CD163共定位细胞数占比显著降低(P<0.05);与PS组相比,MSC组、IS组和MSC+IS组中共定位占比显著增加(P值均<0.000 1),且MSC+IS组与MSC组及IS组相比差异均有统计学意义(P值均<0.000 1)(图78)。

    注: DAPI、CD68、CD163与Merge放大倍数为20,Enlarge放大倍数为63。
    图  7  各组大鼠肝组织免疫荧光染色
    Figure  7.  Immunofluorescence staining of rat liver tissue in each group
    图  8  各组大鼠肝组织巨噬细胞M2型极化占比统计图
    Figure  8.  Statistics of the percentage of macrophage M2 type polarisation in liver tissue of rats in each group

    MSC是一类多能干细胞,具有多向分化潜能和免疫调节作用。其表面低表达组织相容性复合物,具有低免疫原性,不刺激体内免疫反应8。多项体内、体外实验11-13均表明,MSC可向肝细胞分化,修复受损肝组织,降低炎症反应。本研究同样证实了MSC具有免疫调节作用,其抑制大鼠肝移植免疫排斥反应能力与IS相当,但不论是MSC还是IS均未达到最理想疗效。

    免疫排斥反应是肝移植术后常见的病理生理过程,是导致肝移植失败的重要原因14。目前,尚无统一的肝移植术后IS治疗标准,多采用以钙调磷酸酶抑制剂为基础,联合其他药物的免疫抑制方案。常用的三联免疫抑制方案为钙调磷酸酶抑制剂+霉酚酸酯+糖皮质激素,常用的二联免疫抑制方案为钙调磷酸酶抑制剂+霉酚酸酯/糖皮质激素3。由于IS的毒副作用,针对特殊肝移植受者,如:肾功能损伤、糖尿病、高血压等,常规二联和三联免疫抑制方案的使用受限,现有IS方案已不能满足临床需求15-16

    本研究通过构建原位肝移植大鼠模型,注射MSC和IS,观察MSC联合IS抑制免疫排斥的能力。结果显示:与MSC组和IS组相比,MSC+IS组术后15 d肝组织炎症细胞浸润明显少于MSC组和IS组,肝小叶结构完整,基本接近于Normal组。且MSC+IS组降低大鼠肝移植引起的纤维化程度的能力也比MSC组和IS组强。免疫组化进一步分析肝组织炎症细胞浸润情况,结果发现:PS组可见大量T淋巴细胞和NK细胞浸润,MSC组和IS组的浸润明显减少,MSC+IS组仅见少量T淋巴细胞和NK细胞浸润。巨噬细胞M2极化可抑制免疫反应,因此,在肝移植术后增加巨噬细胞M2极化有助于抑制免疫反应,本研究免疫荧光实验也表明,MSC+IS组可以显著增加巨噬细胞M2极化,抑制免疫反应。

    综上所述,MSC联合IS可以抑制大鼠原位肝移植免疫排斥反应。

  • 图  1  MSC的外形鉴定(×20)

    Figure  1.  Shape identification of MSC(×20)

    图  2  MSC的表型鉴定

    Figure  2.  Phenotypic identification of MSC

    图  3  大鼠肝移植后Kaplan-Meier生存曲线

    Figure  3.  Kaplan-Meier survival curve after liver transplantation in rats

    图  4  各组大鼠肝组织病理切片

    Figure  4.  Histopathological sections of rat liver in various groups

    图  5  大鼠肝移植术后肝组织纤维化程度统计图

    Figure  5.  Statistical graph of the degree of fibrosis in liver tissue after liver transplantation in rats

    注: a,免疫组化染色(×40);b、c,CD56、CD3阳性细胞占比统计结果。

    图  6  各组大鼠肝组织CD56、CD3指标免疫组化染色

    Figure  6.  Immunohistochemical staining of rat liver tissue for CD56 and CD3 indicators in each group

    注: DAPI、CD68、CD163与Merge放大倍数为20,Enlarge放大倍数为63。

    图  7  各组大鼠肝组织免疫荧光染色

    Figure  7.  Immunofluorescence staining of rat liver tissue in each group

    图  8  各组大鼠肝组织巨噬细胞M2型极化占比统计图

    Figure  8.  Statistics of the percentage of macrophage M2 type polarisation in liver tissue of rats in each group

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-10
  • 录用日期:  2023-11-08
  • 出版日期:  2024-06-25
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