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microRNA-933对LX-2细胞凋亡和增殖的影响及其分子机制
DOI: 10.12449/JCH240716
Effect of miRNA-933 on the apoptosis and proliferation of LX-2 cells and its molecular mechanism
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摘要:
目的 探讨microRNA-933（miRNA-933）对人肝星状细胞系LX-2细胞凋亡和增殖的调控作用及其机制。 方法 首先以人肝组织为研究对象，利用基因芯片技术，检测肝硬化与慢性乙型肝炎肝组织相较于正常肝组织中差异表达的基因，并从中筛选差异表达显著的miRNA，从而确定研究对象为miRNA-933。进而以人肝星状细胞系LX-2为研究对象，利用miRNA-933分子模拟剂（miRNA-933 mimic）与抑制剂（miRNA-933 siRNA），构建LX-2过表达与敲减模型，并以转染mimic-NC（过表达）或siRNA-NC（敲减）的细胞作为阴性对照。使用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western Blot技术，检测miRNA-933与活化标志蛋白的表达水平；随后采用细胞增殖实验、流式细胞术等技术，检测miRNA-933对细胞凋亡、增殖和活化的影响，并探讨其机制。计量资料两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并经过Bonferroni校正。 结果 基于基因芯片检测结果，最终筛选出18个显著差异表达的miRNA，其中miRNA-933表达显著下调（P<0.05）。miRNA-933 mimic与siRNA转染LX-2细胞后，结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调miRNA-933的表达（P=0.000 7），而miRNA-933 mimic显著上调miRNA-933的表达（P=0.000 3）；Western Blot和qPCR检测结果表明，miRNA-933 siRNA显著上调胶原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（P值均<0.001），而miRNA-933 mimic显著抑制Collagen Ⅰ和α-SMA的表达（P值均<0.05）。流式细胞术检测结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调LX-2细胞凋亡率（P=0.031 9），miRNA-933 mimic显著上调LX-2细胞凋亡率（P=0.005 5）；Western Blot检测结果表明，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA可以抑制LX-2细胞中胱天蛋白酶3（Caspase-3）和多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）的表达（P值分别为0.006 7、0.003 0），上调B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达（P=0.002 0），而miRNA-933 mimic可显著上调Caspase-3（P=0.011 8）和PARP-1（P=0.049 5）的表达，下调Bcl-2的表达（P=0.002 1）。细胞增殖实验结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA可促进LX-2细胞增殖（P=0.011 5）；相反miRNA-933 mimic可抑制LX-2细胞增殖（P=0.001 2）。Western Blot和qPCR检测显示，miRNA-933 siRNA显著抑制Kruppel样因子6（KLF6）的表达，进而下调活化转录因子4（ATF4）、活化转录因子3（ATF3）、C/EBP同源蛋白（CHOP）蛋白的表达，而miRNA-933 mimic会促进以上蛋白的表达（P值均<0.05）。 结论 miRNA-933可能通过促进LX-2细胞中KLF6/ATF4/ATF3/CHOP/Bcl-2信号轴的激活，进而促进细胞凋亡，抑制细胞的活化和增殖。 Abstract:Objective To investigate the regulatory effect of miRNA-933 on the apoptosis and proliferation of human hepatic stellate cell line LX-2 and its mechanism. Methods Firstly， with human liver tissue for research， gene microarray technology was used to detect the differentially expressed genes in liver tissue between liver cirrhosis/chronic hepatitis B tissue and normal liver tissue， among which the significantly differentially expressed miRNAs were identified， and thus miRNA-933 was determined as the research object. Then， with the human hepatic stellate cell line LX-2 for research， miRNA-933 mimic and inhibitor （miRNA-933 siRNA） were used to construct the LX-2 models of overexpression and knockdown， and the cells transfected with mimic-NC （overexpression） or siRNA-NC （knockdown） were established as the negative control group. Quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the expression levels of miRNA-933 and activation biomarkers； techniques such as cell proliferation assay and flow cytometry were used to investigate the effect and mechanism of miRNA-933 on cell apoptosis， proliferation， and activation. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups； a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and Bonferroni correction was also performed. Results A total of 18 significantly differentially expressed miRNAs were obtained based on the results of gene microarray， among which miRNA-933 was significantly downregulated （P<0.05）. After LX-2 cells were transfected with miRNA-933 mimic or siRNA， compared with the negative control group， miRNA-933 siRNA significantly downregulated the expression of miRNA-933 （P=0.000 7）， while miRNA-933 mimic significantly upregulated the expression of miRNA-933 （P=0.000 3）. Western blot and quantitative real-time PCR showed that miRNA-933 siRNA significantly upregulated the expression of collagen I and α-SMA （P<0.001）， while miRNA-933 mimic significantly inhibited the expression of collagen I and α-SMA （P<0.05）. Flow cytometry showed that compared with the negative control group， miRNA-933 siRNA significantly downregulated the apoptosis rate of LX-2 cells （P=0.031 9）， and miRNA-933 mimic significantly upregulated the apoptosis rate of LX-2 cells （P=0.005 5）. Western blot showed that compared with the negative control group， miRNA-933 siRNA could inhibit the expression of Caspase-3 （P=0.006 7） and poly（ADP-ribose） polymerase-1 （PARP-1） （P=0.003 0） and upregulate the expression of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） in LX-2 cells （P=0.002 0）， while miRNA-933 mimic could significantly upregulate the expression of Caspase-3 （P=0.011 8） and PARP-1 （P=0.049 5） and downregulated the expression of Bcl-2 （P=0.002 1）. Cell proliferation assay showed that compared with the negative control group， miRNA-933 siRNA could promote the proliferation of LX-2 cells （P=0.011 5）， while on the contrary， miRNA-933 mimic could inhibit the proliferation of LX-2 cells （P=0.001 2）. Western blot and quantitative real-time PCR showed that miRNA-933 siRNA significantly inhibited the expression of Kruppel-like factor 6 （KLF6） and downregulated the expression of activating transcription factor 4 （ATF4）， activating transcription factor 3 （ATF3）， and C/EBP homologous protein （CHOP）， while miRNA-933 mimic promoted the expression of the above proteins （all P<0.05）. Conclusion This study shows that miRNA-933 may promote cell apoptosis and inhibit cell activation and proliferation by promoting the activation of the KLF6/ATF4/ATF3/CHOP/Bcl-2 signal axis in LX-2 cells. -
Key words:
- Hepatic Fibrosis /
- MicroRNAs /
- Hepatic Stellate Cells
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肝纤维化是由各种形式慢性肝病导致的肝脏结缔组织异常增生，其主要病因包括血吸虫和肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病等［1］。如若不进行治疗，肝纤维化可发展成肝硬化和门静脉高压症、肝性脑病和/或肝功能衰竭，最终可能导致器官衰竭和死亡。肝纤维化的机制极其复杂，涉及大量的细胞和分子事件。目前研究认为，在外源性因素的刺激下，位于窦周间隙的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）被激活，转化为肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质，进而导致肝纤维化病变［2］。肝纤维化的发生和发展受到众多信号通路的调节，包括MAPK信号通路、Wnt信号通路、PI3K/AKT信号通路、Hedgehog/Gli信号通路等［3］。因此，通过抑制相关信号通路的激活，进而抑制HSC的活化并诱导其凋亡，是治疗肝纤维化的重要策略［4］。
microRNA（miRNA）是一类由18～25个核苷酸构成的内源性非编码RNA，其通过与靶mRNA的3′-非编码区结合，调控目的基因的表达，进而参与许多复杂的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和癌变等［5］。因此，miRNA介导的RNA干扰作为一种转录水平调控基因表达的新机制，引起了众多研究者的关注。在肝纤维化病程中有许多miRNA参与其中［6］。例如miRNA-29家族的miRNA-29b通过降低TGF-β/Smad3的激活水平，抑制HSC的活化和肝纤维化的发生［7］。miRNA-34a通过靶向抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员1的表达，调控细胞内脂肪酸的积累，最终抑制HSC的激活［8］。
miRNA-933对HSC的生物学功能及作用机制的研究还未系统报道。因此，本研究通过体外转染技术，将miRNA-933模拟物及其抑制剂转染人肝星状细胞系（LX-2细胞），探讨miRNA-933对HSC生物学功能的影响，为抗肝纤维化治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
如非特殊说明，所有试剂均来自美国Sigma-Aldrich公司。高糖培养基（DMEM）、特级胎牛血清与磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自美国Gibco公司，减血清培养基（OPTI-MEM）购自美国HyClone公司，miRNA-933分子模拟剂（miRNA-933 mimic）与抑制剂（miRNA-933 siRNA）购自上海吉玛制药技术有限公司，LipofectamineTM RNAiMAX、Trizol、RevertAid试剂盒、ECL发光液和RNA反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，CCK-8试剂盒购自美国Promega公司，全RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液和PVDF膜转膜缓冲液购自上海海利克斯公司。兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（货号#4970）、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体（货号#19245）、兔抗人胱天蛋白酶3（Caspase-3，货号#314220）、兔抗鼠多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1，货号#9532）、兔抗人活化转录因子4（ATF4）单克隆抗体（货号#11815）、兔抗人活化转录因子3（ATF3）单克隆抗体（货号#18665）和兔抗人C/EBP同源蛋白（CHOP）单克隆抗体（货号#2895）购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗人胶原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ，货号#19245）、Kruppel样因子6（KLF6）多克隆抗体（货号#241385）购自美国Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
当LX-2细胞培养至合适密度（80%～90%）时，吸弃培养液，加入胰酶消化1 min，随后800×g离心5 min；离心结束后，吸弃上清，重悬细胞，根据细胞数量，将细胞悬液平均分配到2～3个10 cm培养皿中，5% CO2浓度，37 ℃、饱和湿度，静置培养，隔天观察细胞生长情况。
1.2.2 细胞转染
取生长状态良好的LX-2细胞接种于6孔板中，每孔接入1×106个，待细胞贴壁后，将细胞分为5组。不经任何处理的细胞作为空白对照组（Control组），转染miRNA-933 siRNA的细胞为敲减实验组（miRNA-933 siRNA组），转染NC siRNA的细胞为敲减阴性对照组（siRNA-NC组），转染miRNA-933 mimic的细胞为过表达实验组（miRNA-933 mimic组），转染NC mimic的细胞为过表达阴性对照组（mimic-NC组）。细胞转染操作按照LipofectamineTM RNAiMAX说明书进行，6孔板每孔加入转染试剂6 μL、mimic（10 μmol/L）或siRNA（20 μmol/L）3 μL，48 h后进行检测。
1.2.3 总RNA提取与反转录PCR
核酸提取方法按照Trizol法进行，反转录按照Thermo反转录试剂盒操作说明书进行，每20 μL体系加入RNA模板1 000 μg，U6-RT引物1.5 μL，miRNA-933-RT 1.5 μL，dNTP 2 μL，reaction buffer 4 μL，RI 1 μL，RT 1 μL，剩余不足用水补齐。
1.2.4 基因芯片检测
为明确肝病患者与健康人肝组织中miRNA的表达变化，本研究利用基因芯片技术，检测慢性乙型肝炎与肝硬化患者相较于健康人肝组织中miRNA的表达差异。由北京诺禾致源科技股份有限公司进行基因芯片检测。使用Expression Console软件提取原始探针信号值，通过RMA算法对原始数据进行校正和标准化处理，应用Transcriptome Analysis Console软件分析各组转录本差异。
1.2.5 实时荧光定量PCR（qPCR）检测
使用TransStart Tip Green qPCR Super Mix进行qPCR检测，反应体系为20 μL，反应条件设置为60 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，总共设置40个循环，数据采用2-∆∆Ct法进行分析，引物信息见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences引物 序列（5′-3′） miRNA-933 F：ACACTCCAGCTGGCTGTGTGCGCAGGG‑AGACCTC R：TGGTGTCGTGGAGTCG U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA R：AACGCTTCACGAATTTGCGT miRNA-933-RT UGUGCGCAGGGAGACCUCUCCC miRNA-933 mimic CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG NC mimic UUCUCCGAACGUGUCACGUTT miRNA-933 siRNA GUUUCACGGAGGGAAAUCUCAC NC siRNA CAGUACUUUUGUGUAGUACCAA 1.2.6 Western Blot检测
使用江苏凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后分别过夜孵育α-SMA（1∶2 000稀释）、Collagen Ⅰ（1∶2 000稀释）、Caspase-3（1∶2 000稀释）、PARP-1（1∶2 000稀释）、ATF4（1∶2 000稀释）、ATF3（1∶2 000稀释）、CHOP以及β-actin（1∶5 000稀释）蛋白抗体。
1.2.7 流式细胞术检测凋亡率
按照江苏凯基凋亡/坏死检测试剂盒说明书进行操作，每组细胞处理结束后，消化收集细胞，用500 μL binding buffer重悬细胞，每组加入2 μL Annexin Ⅴ染料，3 μL PI染料，37 ℃避光孵育30 min。离心弃上清，PBS清洗一遍后，用binding buffer重悬细胞，上机检测。
1.2.8 CCK-8检测细胞增殖率
应用江苏凯基CCK-8试剂盒，操作步骤简略如下：将生长状态良好的LX-2细胞每孔1×105个接入96孔板中，贴壁后按照实验设计处理，随后按照每孔溶液体积的1/10加入CCK-8试剂，2 h后利用酶标仪检测450 nm波长下吸光度，以LX-2空白细胞吸光度为参比，计算各组增殖率。
1.2.9 克隆形成实验
取对数期生长的细胞，细胞计数后以每孔1 000个细胞数接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2条件下培养48 h后，移除培养液，使用40 g/L多聚甲醛固定15 min，随后去除多聚甲醛，加入结晶紫染液复染10 min；流水缓慢洗去染液，显微镜下计数每孔克隆形成数。
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析。计量资料以
2. 结果
2.1 肝组织中差异表达miRNA的筛选与验证
基因芯片检测结果如图1a、b所示，肝病患者与健康人肝组织中miRNA表达谱具有明显差异，根据差异倍数筛选出上调的miRNA 10个，下调的miRNA 8个。随后，利用qPCR技术验证芯片结果，如图1c、d所示，筛选获得的18个miRNA qPCR检测结果与芯片结果保持一致，其中miRNA-933下调最为明显。
注： a、b，基因芯片技术检测肝硬化与慢性乙型肝炎患者肝组织中miRNA的差异表达，*P<0.05；c、d，qPCR检测健康人与肝病患者肝组织中miRNA的差异表达。图 1 肝组织中差异表达的miRNA筛选Figure 1. The verified of differential expression miRNA in liver tissues2.2 miRNA-933对LX-2细胞活化的影响
为探讨miRNA-933对肝细胞生物学功能的影响，本研究合成miRNA-933的mimic与siRNA，转染入LX-2后利用qPCR检测各组细胞中miRNA-933相对表达水平。结果如图2a所示，miRNA-933 mimic组的miRNA-933相对表达量明显高于mimic-NC组（P=0.000 3）；miRNA-933 siRNA组的miRNA-933相对表达量明显低于siRNA-NC组（P=0.000 7），miRNA-933过表达与敲减模型构建成功。
注： a，miRNA-933 mimic和siRNA对LX-2细胞中miRNA-933表达的影响；b、c，qPCR检测LX-2细胞中Collagen Ⅰ和α-SMA mRNA的表达情况；d～f，Western Blot检测LX-2细胞中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表达情况。图 2 miRNA-933对LX-2细胞活化的影响Figure 2. The effect of miRNA-933 on the activation of LX-2 cells为验证miRNA-933对LX-2活化的影响，本研究利用qPCR和Western Blot分别检测各组细胞中活化标志物Collagen Ⅰ和α-SMA的表达情况。结果如图2b～f所示，与siRNA-NC组相比，miRNA-933 siRNA在核酸和蛋白水平均显著促进α-SMA和Collagen Ⅰ的表达（P值均<0.001）；另一方面，与mimic-NC组相比，miRNA-933 mimic显著抑制α-SMA和Collagen Ⅰ mRNA与蛋白的表达（P值均<0.05），推测miRNA-933可抑制HSC的激活。
2.3 miRNA-933对LX-2细胞凋亡的影响
利用流式细胞术结合Annexin V/PI双染法，检测miRNA-933 siRNA组和miRNA-933 mimic组凋亡率变化，结果如图3a所示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调了LX-2细胞凋亡率（P=0.031 9），而miRNA-933 mimic处理后，细胞凋亡率显著升高（P=0.005 5）。进一步通过Western Blot检测各组细胞中抑凋亡关键因子B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和凋亡关键因子Caspase-3/PARP-1的表达变化（图3b），结果与流式细胞术检测结果相符，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调Caspase-3（P=0.006 7）和PARP-1（P=0.003 0）的表达，上调Bcl-2的表达（P=0.002 0），而miRNA-933 mimic显著上调Caspase-3（P=0.011 8）和PARP-1（P=0.049 5）的表达，下调Bcl-2的表达（P=0.002 1）。上述研究结果表明，miRNA-933可促进HSC凋亡。
注： a，流式细胞仪检测LX-2细胞凋亡率；b，Western Blot检测LX-2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP-1和Caspase-3的表达情况。图 3 miRNA-933对LX-2细胞凋亡的影响Figure 3. The effect of miRNA-933 on regulating apoptosis of LX-2 cells2.4 miRNA-933对LX-2细胞增殖的影响
将miRNA-933转染LX-2后，分别在24、48、72、96 h观察miRNA-933对各组LX-2细胞增殖的影响。细胞集落形成检测结果表明，与siRNA-NC组相比，miRNA-933 siRNA组细胞集落显著增加（P=0.011 5）；与mimic-NC组比较，miRNA-933 mimic组细胞集落显著减少（P=0.001 2）。CCK-8检测结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA组细胞存活率显著增加（P=0.010 3），miRNA-933 mimic组细胞存活率显著下降（P=0.007）（图4）。
注： a，细胞集落实验检测各组细胞集落形成；b，细胞集落实验统计学分析结果；c，CCK-8实验检测细胞存活率。图 4 miRNA-933对LX-2细胞增殖的影响Figure 4. The effect of miRNA-933 on regulating proliferation of LX-2 cells2.5 miRNA-933对KLF6/ATF4/ATF3/CHOP信号轴激活的影响
为进一步明确miRNA-933调控LX-2细胞生物学功能的相关机制，本研究利用Western Blot技术，检测了敲减与过表达miRNA-933后，其下游增殖关键蛋白因子KLF6的表达情况。结果如图5a、b所示，敲减miRNA-933显著抑制KLF6蛋白的表达（P=0.017），而过表达miRNA-933显著促进了KLF6蛋白的表达（P=0.039）。KLF6是肿瘤抑制因子，可以通过ATF4-ATF3-CHOP信号轴促进细胞凋亡的发生。
注： a，Western Blot检测KLF6/ATF4/ATF3/CHOP蛋白表达；b～e，Western Blot半定量分析结果。图 5 miRNA-933对KLF6/ATF4/ATF3/CHOP信号轴激活的影响Figure 5. The effect of miRNA-933 on the activation KLF6/ATF4/ATF3/CHOP axis为验证miRNA-933调控细胞凋亡的具体机制，本研究进一步检测了ATF4/ATF3/CHOP蛋白的表达，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调了ATF4（P=0.039）、ATF3（P=0.007）和CHOP（P=0.012）的表达，而miRNA-933 mimic显著上调了ATF4（P=0.000 5）、ATF3（P=0.000 9）和CHOP（P=0.004）的表达（图5c～e）。
3. 讨论
作为一种内源性非编码RNA，miRNA广泛分布于生物体的多种组织器官中，并通过碱基互补配对，在转录水平调控基因的表达［9］。研究［10］发现，miRNA可调控包括细胞增殖、分化、代谢和凋亡在内的多种生物学进程，其表达异常也与多种疾病的发生发展有密切联系，其中包括肝纤维化。肝纤维化是许多慢性肝病不可避免的病理过程，其病理特征是细胞外基质的过量累积［11］，而活化的HSC作为细胞外基质的主要生产来源，在肝纤维化的进展中起着至关重要的作用［12］。
HSC的活化受到众多miRNA的调控。例如，miRNA-29家族的miRNA-29b与miRNA-29a在休眠期的HSC中表达量极高。miRNA-29b通过靶向结合在PI3KR1和AKT3的3′-非编码区，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，进而阻止HSC的激活与纤维化的发生［13-14］。而miRNA-29a通过降低组蛋白脱乙酰酶4的活性，从而抑制HSC的活化［15］。此外另有研究［16］表明，在活化的大鼠HSC中，miRNA-15b和miRNA-16的表达明显增加。miRNA-15b与miRNA-16靶向Bcl-2，抑制其表达，进而促进HSC凋亡，抑制肝纤维化进程。本研究发现，相较于健康人肝组织，慢性肝病患者肝组织中miRNA-933的表达显著下降。
miRNA-933的表达不具有组织特异性，在机体的多种组织中均有表达。在口腔鳞状细胞癌的研究［17］中发现，miRNA-933可影响口腔鳞状细胞的增殖、迁移与凋亡。肺癌的研究［18］中发现，过表达miRNA-933可抑制A549和H460细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此外，miRNA-933的单核苷酸多态性位点rs79402775还会提高良性甲状腺瘤的患病风险［19］。本研究也发现，在LX-2细胞中，miRNA-933过表达能显著抑制LX-2细胞增殖，促进细胞凋亡的发生。
miRNA-933的靶基因较多。如在乳腺癌的研究［20］中发现，miRNA-933通过下调Sma同源物2的表达促进了癌细胞的增殖和侵袭。在HBV感染过程中发现，miRNA-933通过抑制人组蛋白去乙酰化酶11的表达，促进了HBV在细胞中的复制［21］。在2型糖尿病和神经退行性疾病的研究［22］中发现，miRNA-933可以抑制ATF2，但能上调脑源性神经营养因子，最终影响疾病进展。在肺癌的研究［18］中发现，miRNA-933可通过促进KLF6的表达，进而影响细胞的增殖、迁移和侵袭，这与本研究的发现相同。KLF6是特异性蛋白1/Kruppel转录因子家族的成员之一，最初是从白细胞克隆而来［23］。研究［24］表明，KLF6是一种肿瘤抑制蛋白，在包括前列腺癌、肾癌在内的多种癌症中下调或突变。在小鼠肝癌模型的研究［25］中发现，KLF6通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶p21 WAF1/Cip1抑制肿瘤生长。KLF6还与细胞周期蛋白D1直接相互作用，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4并导致细胞周期停滞［26］。此外，在非小细胞肺癌和前列腺癌的研究［27-28］中发现，KLF6过表达促进了凋亡的发生。而在肝细胞癌的研究［29］中也发现，KLF6增加了HSC对凋亡应激的敏感性。作为转录调控因子，KLF6能够调控内质网应激通路关键蛋白ATF4的表达，并激活内质网应激通路。ATF4被激活后，会结合ATF3基因的上游ATF/cAMP反应元件，从而级联激活ATF3/CHOP，最终CHOP剪切抑凋亡蛋白Bcl-2，促进细胞凋亡的发生［30］。本研究结果显示，miRNA-933促进了LX-2细胞中KLF6/ATF4/ATF3/CHOP/Bcl-2信号轴的激活，推测是miRNA-933调控LX-2细胞增殖、迁移和凋亡的分子机制。关于miRNA-933如何调控KLF6的表达，其具体分子机制有待进一步阐明。
综上所述，本研究发现，相较于正常肝组织，肝硬化与慢性乙型肝炎肝组织中miRNA-933表达量下降。进一步分析显示，miRNA-933促进了KLF6的表达，抑制了HSC活化与增殖，并通过ATF4/ATF3/CHOP信号通路，促进HSC的凋亡。推测miRNA-933可抑制肝纤维化的进展，为肝纤维化的治疗提供了新的方向。
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注： a、b，基因芯片技术检测肝硬化与慢性乙型肝炎患者肝组织中miRNA的差异表达，*P<0.05；c、d，qPCR检测健康人与肝病患者肝组织中miRNA的差异表达。
图 1 肝组织中差异表达的miRNA筛选
Figure 1. The verified of differential expression miRNA in liver tissues
注： a，miRNA-933 mimic和siRNA对LX-2细胞中miRNA-933表达的影响；b、c，qPCR检测LX-2细胞中Collagen Ⅰ和α-SMA mRNA的表达情况；d～f，Western Blot检测LX-2细胞中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表达情况。
图 2 miRNA-933对LX-2细胞活化的影响
Figure 2. The effect of miRNA-933 on the activation of LX-2 cells
注： a，流式细胞仪检测LX-2细胞凋亡率；b，Western Blot检测LX-2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP-1和Caspase-3的表达情况。
图 3 miRNA-933对LX-2细胞凋亡的影响
Figure 3. The effect of miRNA-933 on regulating apoptosis of LX-2 cells
注： a，细胞集落实验检测各组细胞集落形成；b，细胞集落实验统计学分析结果；c，CCK-8实验检测细胞存活率。
图 4 miRNA-933对LX-2细胞增殖的影响
Figure 4. The effect of miRNA-933 on regulating proliferation of LX-2 cells
注： a，Western Blot检测KLF6/ATF4/ATF3/CHOP蛋白表达；b～e，Western Blot半定量分析结果。
图 5 miRNA-933对KLF6/ATF4/ATF3/CHOP信号轴激活的影响
Figure 5. The effect of miRNA-933 on the activation KLF6/ATF4/ATF3/CHOP axis
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
引物 序列（5′-3′） miRNA-933 F：ACACTCCAGCTGGCTGTGTGCGCAGGG‑AGACCTC R：TGGTGTCGTGGAGTCG U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA R：AACGCTTCACGAATTTGCGT miRNA-933-RT UGUGCGCAGGGAGACCUCUCCC miRNA-933 mimic CAAAGUGCCUCCCUUUAGAGUG NC mimic UUCUCCGAACGUGUCACGUTT miRNA-933 siRNA GUUUCACGGAGGGAAAUCUCAC NC siRNA CAGUACUUUUGUGUAGUACCAA 
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