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一贯煎对M1型骨髓巨噬细胞治疗肝硬化大鼠模型效果的影响及其机制分析
DOI: 10.12449/JCH240817
Effect of Yiguan Decoction on the efficacy of M1 bone marrow-derived macrophages in treatment of liver cirrhosis rats and its mechanism
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摘要:
目的 观察一贯煎对M1型骨髓巨噬细胞（M1-BMDM）治疗2-AAF/CCl4诱导的大鼠肝硬化作用的影响与机制。 方法 分离BMDM，脂多糖诱导分化为M1-BMDM。雄性Wistar大鼠随机分为正常组（n=5）和造模组（n=45）。造模组大鼠予以50% CCl4每周2次皮下注射。第7周开始，将造模大鼠随机分为模型组（M组）、一贯煎组（YGJD组）、M1-BMDM组、M1-BMDM+YGJD组、索拉非尼组（SORA组），改用30% CCl4皮下注射以维持肝硬化进展，同时以2-AAF灌胃，且饮水中加入CCR2抑制剂，分组干预，9周末取材。观察血清肝功能、肝组织病理、肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量、肝星状细胞活化、肝纤维化及炎症相关因子、Wnt信号通路相关分子表达水平等。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与M组比较，M1-BMDM+YGJD组大鼠血清ALT、AST、TBil水平均明显降低（P值均<0.05），Alb含量显著增加（P<0.05）；与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组血清TBil含量显著降低（P<0.05）、Alb含量显著升高（P<0.05）。与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组CD68、TNF-α表达显著降低（P<0.05）。与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组Hyp含量及天狼星红胶原阳性染色面积均显著降低（P值均<0.05）。M1-BMDM+YGJD组非经典Wnt信号通路分子Wnt5a mRNA和蛋白表达均显著低于M1-BMDM组（P值均<0.05），Fzd2 mRNA表达水平显著低于M1-BMDM组（P<0.05），且Wnt4、Wnt5b和Fzd3 mRNA表达水平亦显著降低（P值均<0.05），而经典Wnt信号通路分子β-catenin、LRP5、LRP6、Fzd5和TCF mRNA表达水平均无明显改变。 结论 一贯煎可提高M1-BMDM对2-AAF/CCl4诱导的大鼠肝硬化的治疗效应，其机制可能与抑制非经典Wnt5a/Fzd2信号通路有关，为中医药协同M1-BMDM治疗肝硬化提供了新思路。 -
关键词:
- 肝硬化 /
- 巨噬细胞 /
- 一贯煎 /
- Wnt信号通路 /
- 大鼠， Wistar
Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of Yiguan Decoction （YGJD） on the efficacy of M1 bone marrow-derived macrophages （M1-BMDMs） in the treatment of rats with liver cirrhosis induced by 2-AAF/CCl4. Methods BMDMs were isolated and induced into M1-BMDMs by lipopolysaccharide. A total of 50 male Wistar rats were randomly divided into normal group with 5 rats and model group with 45 rats. The rats for modeling were given subcutaneous injection of 50% CCl4 twice a week. Since week 7， the rats for modeling were randomly divided into model group （M group）， YGJD group， M1-BMDM group， M1-BMDM+YGJD group， and sorafenib （SORA） group， and they were given subcutaneous injection of 30% CCl4 to maintain the progression of liver cirrhosis and intragastric administration of 2-AAF. CCR2 inhibitors were added to the drinking water， and each group was given the corresponding intervention. Related samples were collected at week 9. The rats were observed in terms of serum liver function parameters， liver pathology， hydroxyproline （Hyp） content in liver tissue， hepatic stellate cell activation， hepatic fibrosis and inflammation factors， and the expression levels of molecules associated with the Wnt signaling pathway. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the M group， the M1-BMDM+YGJD group had significant reductions in the serum levels of alanine aminotransferase， aspartate aminotransferase， and total bilirubin （TBil） （all P<0.05） and a significant increase in the content of albumin （Alb） （P<0.05）， and compared with the M1-BMDM group， the M1-BMDM+YGJD group had a significant reduction in the serum level of TBil （P<0.05） and a significant increase in the serum level of Alb （P<0.05）. Compared with the M1-BMDM group， the M1-BMDM+YGJD group had significant reductions in the expression levels of CD68 and TNF-α （P<0.05）. Compared with the M1-BMDM group， the M1-BMDM+YGJD group had significant reductions in Hyp content and Sirius red positive area （P<0.05）. As for the non-canonical Wnt signaling pathway molecules， compared with the M1-BMDM group， the M1-BMDM+YGJD group had significantly lower mRNA and protein expression levels of Wnt5a （P<0.05） and mRNA expression level of Fzd2 （P<0.05）， as well as significant reductions in the mRNA expression levels of Wnt4， Wnt5b， and Fzd3 （P<0.05）， while there were no significant changes in the mRNA expression levels of the canonical Wnt signaling pathway molecules β-catenin， LRP5， LRP6， Fzd5， and TCF. Conclusion YGJD can enhance the therapeutic effect of M1-BMDMs on rats with liver cirrhosis induced by 2-AAF/CCl4， possibly by inhibiting the non-canonical Wnt5a/Fzd2 signaling pathway， which provides new ideas for the synergistic effect of traditional Chinese medicine on M1-BMDMs in the treatment of liver cirrhosis. -
Key words:
- Liver Cirrhosis /
- Macrophages /
- Yi Guan Jian /
- Wnt Signaling Pathway /
- Rats， Wistar
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肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理阶段［1］。肝移植是国际公认的终末期肝硬化的最佳治疗手段［2］。但受供体缺乏、费用昂贵及移植相关并发症等限制，使部分患者在等待供肝期间死亡［3］。肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的关键细胞学基础，而巨噬细胞在HSC活化的过程中发挥关键作用［4］。在肝纤维化发生与发展阶段，巨噬细胞可激活HSC，释放大量细胞外基质（ECM）；而在肝纤维化恢复阶段，巨噬细胞又可降解ECM和抑制肝脏炎性反应［5-7］。此外，巨噬细胞可根据外界信号刺激在M1和M2之间进行表型转换［8］。课题组前期研究证实外源性M1型和M2型骨髓来源巨噬细胞均可有效抑制CC14诱导的大鼠肝纤维化进展［9］。
一贯煎出自《续名医类案》，主治肝肾阴虚，肝气郁滞证。前期研究表明一贯煎可通过调控Wnt信号通路发挥抗肝纤维化作用［10］，但尚不清楚该方是否会影响M1型骨髓巨噬细胞（M1-BMDM）治疗肝硬化的效应，本文就此开展初步研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（REOPP-07012）购于Cyagen公司；一贯煎颗粒剂购于江阴天江药业有限公司（批号1501361）；二乙酰氨基芴（2-AAF）（A-1075）购于Sigma-Aldrich有限公司；CCR2抑制剂（RS-102895）购于CSNpharm公司；SORA（475207-59-1）购自CHEMLFADER公司；α-SMA抗体（ab124964）、CD68抗体（a125212）、TNF-α抗体（ab205587）购自Abcam公司；CD206（18704-1-AP）、GAPDH（10494-1-AP）购自Proteintech公司；Wnt5a抗体（#53430）购自Signalway Antibody公司；Fzd2抗体（AF04745）购自艾方生物公司；β-catenin抗体（sc-7963）购自Santa Cruz Biotechnology公司。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 BMDM的分离、极化与鉴定
参考Davis、Watanabe、Mily等［11-13］的方法，课题组已建立成熟的极化及鉴定M1-BMDM的实验技术。分离得到的骨髓原代巨噬细胞，采用5 ng/mL脂多糖诱导其极化为M1表型，并进行鉴定［9］。
1.3 动物
雄性Wistar大鼠50只，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，体质量（180±20）g，实验动物使用许可证编号：SYXK（沪）2021-0009，生产许可证编号：SCXK（沪）2019-0021。饲养于上海中医药大学实验动物中心。
1.4 模型制备、分组与干预
Wistar大鼠随机分为正常组（N组，n=5）和造模组（n=45）。造模组大鼠以1 mL/kg皮下注射50% CCl4-橄榄油溶液，2次/周。自第7周开始，造模大鼠随机分为模型组（M组）、一贯煎组（YGJD组）、M1-BMDM组、M1-BMDM+YGJD组、索拉非尼组（SORA，阳性对照药物），每组9只。予以30% CCl4-橄榄油溶液1 mL/kg皮下注射，2次/周，以维持肝纤维化进展；同时予以2-AAF 10 mg/kg灌胃，1次/d，以抑制肝细胞增殖；并在饮水中加入CCR2抑制剂0.05 g/L以阻断外周巨噬细胞向肝脏浸润。第7周第1天，M1-BMDM组和M1-BMDM+YGJD组大鼠经尾静脉一次性注射M1-BMDM 1×106个细胞/只。同时，YGJD组和M1-BMDM+YGJD组予以一贯煎2.64 g/kg灌胃，SORA组给予SORA 10 mg/kg灌胃，其余各组予以等体积生理盐水灌胃，1次/d。第9周末取材，留取血清及肝组织样本。
1.5 血清肝功能检测
血清ALT、AST、TBil、Alb由上海中医药大学附属曙光医院检验科检测。
1.6 肝组织病理与免疫组织化学染色
石蜡切片脱蜡复水，梯度乙醇脱水，HE染色或天狼星红胶原染色。光镜下观察肝组织炎性损伤及胶原沉积情况，用Image Scope软件计算胶原染色面积比。
免疫组化方法参考文献［14］，石蜡切片脱蜡复水，滴加一抗α-SMA（1∶2 000）、CD68（1∶1 000）、CD206（1∶10 000）、Wnt5a（1∶200）、Fzd2（1∶500）、β-catenin（1∶200），4 ℃过夜。二抗孵育30 min，DAB显色，封片，数字病理信息扫描仪扫描分析。
1.7 肝脏羟脯氨酸（Hyp）含量测定
精确称取肝组织50 mg，采用碱水解法测定肝组织Hyp含量。
1.8 实时荧光定量PCR （qRT-PCR）
总RNA提取采用RNA纯化试剂盒（Lot.360502，Toyobo公司），实验步骤参考说明书进行，mRNA表达检测采用SYBR Green PCR Master Mix反应体系，加入1 μL cDNA至384孔板，ViiA™ 7 real-time PCR System上机检测。检测指标为α- SMA、CD68、CD206、TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-10、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Fzd2、Fzd3、Fzd5、Fzd6、ATF、c-Jun、β- catenin、LRP5、LRP6、LEF和TCF。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.9 免疫印迹
取肝组织50 mg加入RIPA缓冲液裂解，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，测定上清液蛋白浓度，10%或12%凝胶电泳，转膜，快速封闭液封闭0.5 h，一抗4 ℃孵育过夜，检测α-SMA（1∶5 000）、CD68（1∶1 000）、CD206（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、Wnt5a（1∶3 000）、Fzd2（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）。二抗室温下孵育1 h，ECL显影，使用image J分析计算灰度值积分。
1.10 统计学方法
采用SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料以
2. 结果
2.1 一贯煎可提高M1-BMDM改善肝脏炎症反应的作用
HE染色显示，M组大鼠肝组织可见大量炎性细胞浸润、肝小叶结构紊乱和完整纤维间隔形成；与M组比较，各药物干预组肝脏炎症反应程度明显减轻，尤以M1-BMDM+YGJD组改善更为明显（图1a）。
注： a，HE染色；b、c，CD68和CD206免疫组化染色；d，血清生化学指标；e，CD68、CD206、TNF-α免疫印迹及灰度积分比值；f，CD68、CD206、TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表达水平。*P<0.05；**P<0.01。图 1 一贯煎对M1-BMDM改善肝脏炎症反应的作用Figure 1. YGJD can ameliorate the effect of M1-BMDM on improving liver inflammatory血清生化检测结果显示，与M组比较，各药物干预组血清ALT和AST活性显著降低（P值均<0.01），YGJD和M1-BMDM+YGJD组血清TBil水平显著降低（P值均<0.05），M1-BMDM+YGJD组血清Alb显著升高（P<0.05）；且与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组血清TBil水平显著降低，Alb含量显著升高（P值均<0.05）（图1d）。
免疫组化染色显示，与N组比较，M组CD68阳性表达明显增加，CD206阳性表达明显减少；与M组比较，各干预组CD68表达均明显减少，CD206表达明显增加，且M1-BMDM+YGJD组改善优于M1-BMDM组（图1b、c）。CD68和CD206免疫印迹结果显示相同的趋势（图1e）。
与N组比较，M组CD68、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平均显著升高（P值均<0.01），CD206、IL-10 mRNA表达水平显著降低（P值均<0.01）；与M组比较，M1-BMDM+YGJD组CD68、TNF-α表达水平显著降低（P值均<0.05），各用药干预组的IL-6表达水平均显著降低（P值均<0.01）；与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组CD68、TNF-α表达水平显著降低（P值均<0.05）（图1f）。TNF-α的免疫印迹结果与其mRNA结果吻合（图1e）。
2.2 一贯煎可提高M1-BMDM治疗肝硬化的作用
天狼星红胶原染色显示，M组肝组织可见大量的胶原纤维间隔形成，部分形成完整的假小叶结构；与M组比较，各干预组胶原沉积均明显减少；且M1-BMDM+YGJD组明显优于M1-BMDM组（图2a）。Hyp和天狼星红胶原染色阳性面积变化结果显示相同的趋势（图2c、d）。
注： a，天狼星红胶原染色；b，α-SMA免疫组织化学染色；c，肝组织Hyp含量；d，天狼星红胶原染色半定量分析；e，α-SMA免疫印迹和灰度积分比值及mRNA水平；f，TGF-β1 mRNA水平。*P<0.05；**P<0.01。图 2 一贯煎对M1-BMDM治疗肝硬化的作用Figure 2. YGJD can enhance the therapeutic effect of M1-BMDM on liver cirrhosis免疫组化染色显示，M组可见大量α-SMA表达于汇管区和纤维间隔；与M组比较，各干预组α-SMA阳性表达均明显减少。α-SMA mRNA及免疫印迹结果显示相同的趋势（图2b、e）。与N组比较，M组TGF-β1 mRNA表达显著增加（P<0.01）；与M组比较，YGJD和M1-BMDM+YGJD组的TGF-β1表达均显著降低（P值均<0.05）；且M1-BMDM+YGJD组TGF-β1表达显著低于M1-BMDM组（P<0.05）（图2f）。
2.3 一贯煎与M1-BMDM联用对肝脏非经典Wnt信号通路的影响
免疫组化染色显示，M组大量Wnt5a、Fzd2阳性表达；与M组比较，各用药干预组Wnt5a、Fzd2阳性表达均有不同程度的减少；且M1-BMDM+YGJD组Wnt5a、Fzd2表达较M1-BMDM组明显减少（图3a、b）。Wnt5a、Fzd2 mRNA及免疫印迹结果与其基本一致（图3c、d）。
注： a，Wnt5a免疫组化染色；b，Fzd2免疫组化染色；c，Wnt5a、Fzd2免疫印迹及灰度积分比值；d，Wnt5a、Fzd2、Wnt4、Wnt5b、Fzd3、Fzd6、ATF、c-Jun mRNA表达水平。*P<0.05；**P<0.01。图 3 一贯煎与M1-BMDM联用对肝脏非经典Wnt信号通路的影响Figure 3. The effect of combination of YGJD and M1-BMDM on non classical Wnt signaling pathway in the liver此外，与N组比较，M组肝组织Wnt4、Wnt5b、Fzd3、Fzd6和ATF mRNA表达均显著升高（P值均<0.01），c-Jun mRNA表达显著降低（P<0.01）；与M组比较，各干预组Wnt5b mRNA表达水平均显著降低（P值均<0.01），YGJD组和M1-BMDM+YGJD组Wnt4、Fzd3表达均显著降低（P值均<0.05）；与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组Wnt4、Wnt5b、Fzd3表达显著降低（P值均<0.05），c-Jun表达显著升高（P<0.05）（图3d）。
2.4 一贯煎与M1-BMDM联用对肝脏经典Wnt信号通路的影响
免疫组化染色显示，N组可见大量β-catenin阳性表达；与N组比较，M组阳性表达明显减少；各干预组相比于M组无明显改善（图4a）。经典Wnt信号通路相关分子mRNA检测结果显示，与N组比较，M组β-catenin、LRP5、LRP6、Fzd5和TCF表达均显著降低（P值均<0.05）；与M组比较，M1-BMDM+YGJD组LEF、TCF表达显著增加（P值均<0.05）；与M1-BMDM组比较，M1-BMDM+YGJD组LEF表达显著增加（P<0.05）（图4b）。
注： a，β-catenin免疫组化染色；b，β-catenin、LRP5、LRP6、Fzd5、LEF、TCF mRNA表达水平。*P<0.05；**P<0.01。图 4 一贯煎与M1-BMDM联用对肝脏经典Wnt信号通路的影响Figure 4. The effect of combination of YGJD and M1-BMDM on the classic Wnt signaling pathway in the liver3. 讨论
中医无“肝硬化”病名，根据其临床表现，可归属为“胁痛”“黄疸”“积聚”等病证。经典名方“一贯煎”由生地黄、麦冬、北沙参、枸杞、当归、川楝子六味中药组成，具有滋阴疏肝之功，临床上广泛应用于肝硬化肝肾阴虚证的治疗［15-16］。课题组前期研究［9］表明M1-BMDM可通过抑制HSC活化、激活抗炎巨噬细胞来改善CCl4诱导的大鼠肝纤维化进程；本研究进一步发现一贯煎可提高M1-BMDM治疗2-AAF/CCl4诱导的大鼠肝硬化的效果。
在正常肝脏中，巨噬细胞以Kupffer细胞为主，主要参与机体防御、创伤愈合和免疫调节等体内过程［17］。M1-BMDM是具有促炎和免疫调节作用的高效效应细胞。但最近有研究［18］发现尾静脉注射外源性M1-BMDM能够有效干预小鼠肝纤维化进程。本实验发现一贯煎联合M1-BMDM能够有效减轻2-AAF/CCl4诱导大鼠肝硬化的肝脏炎症反应及肝纤维化进展，且效果优于单用M1-BMDM。提示一贯煎可提高M1-BMDM的抗肝纤维化效应。肝纤维化初期，活化的M1型巨噬细胞可通过释放TGF-β1、血小板生长因子等促纤维化因子激活HSC，促进ECM沉积，加速肝硬化进程［19-21］。本研究发现与单用M1-BMDM相比，一贯煎联合M1-BMDM能够显著改善模型组大鼠的肝脏胶原沉积、下调肝脏TGF-β1的表达水平。这可能与一贯煎可提高外源性M1-BMDM对肝脏内Ly6Clow单核巨噬细胞向肝纤维化部位募集的促进作用，减轻肝脏炎症，促使活化的HSC凋亡有关［22］。
Wnt信号通路高度保守，在胚胎发育、器官形成及调控细胞迁移、生长、分化过程中起重要作用［23］。按照信号传导方式的不同分为经典Wnt信号通路（也称Wnt/β-catenin信号通路）和非经典Wnt信号通路［24］。在肝纤维化进展期，M1-BMDM可分泌炎症因子促进HSC活化、激活炎症反应和非经典Wnt信号通路（如Wnt5/Fzd2），促进肝祖细胞向肌成纤维细胞分化，加速肝纤维化进程［25-26］。研究［27］报道一贯煎能通过降低Wnt1、β-catenin的表达来显著改善二甲基亚硝胺诱导的小鼠肝纤维化。本研究发现一贯煎联用M1-BMDM能够显著降低Wnt5a和Fzd2的mRNA及蛋白表达水平，但对经典Wnt信号通路的关键蛋白β-catenin表达无明显改善作用，提示抑制非经典Wnt5a/Fzd2信号通路可能是一贯煎提高M1-BMDM治疗肝硬化效果的关键效应机制。
综上所述，一贯煎可提高M1-BMDM对2-AAF/CCl4诱导的大鼠肝硬化的治疗作用，其机制可能与其抑制非经典Wnt5a/Fzd2信号通路活化有关，具体机制有待进一步深入研究。
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注： a，HE染色；b、c，CD68和CD206免疫组化染色；d，血清生化学指标；e，CD68、CD206、TNF-α免疫印迹及灰度积分比值；f，CD68、CD206、TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表达水平。*P<0.05；**P<0.01。
图 1 一贯煎对M1-BMDM改善肝脏炎症反应的作用
Figure 1. YGJD can ameliorate the effect of M1-BMDM on improving liver inflammatory
注： a，天狼星红胶原染色；b，α-SMA免疫组织化学染色；c，肝组织Hyp含量；d，天狼星红胶原染色半定量分析；e，α-SMA免疫印迹和灰度积分比值及mRNA水平；f，TGF-β1 mRNA水平。*P<0.05；**P<0.01。
图 2 一贯煎对M1-BMDM治疗肝硬化的作用
Figure 2. YGJD can enhance the therapeutic effect of M1-BMDM on liver cirrhosis
注： a，Wnt5a免疫组化染色；b，Fzd2免疫组化染色；c，Wnt5a、Fzd2免疫印迹及灰度积分比值；d，Wnt5a、Fzd2、Wnt4、Wnt5b、Fzd3、Fzd6、ATF、c-Jun mRNA表达水平。*P<0.05；**P<0.01。
图 3 一贯煎与M1-BMDM联用对肝脏非经典Wnt信号通路的影响
Figure 3. The effect of combination of YGJD and M1-BMDM on non classical Wnt signaling pathway in the liver
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