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慢性HBV感染者组织学免疫耐受状态无创诊断指标及相关模型的建立与评价
DOI: 10.12449/JCH241208
Noninvasive diagnostic indicators for histologically defined immune tolerance state in patients with chronic HBV infection and establishment and assessment of related models
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摘要:
目的 慢性HBV感染自然史多有组织学意义上的免疫耐受状态，免疫耐受状态一旦打破，需立即启动抗病毒治疗。通过对免疫介导的肝损伤与HBV病毒学指标进行相关性分析，精准定义肝组织学免疫耐受状态的患者。 方法 以2010年1月—2022年12月中国人民解放军总医院第五医学中心、天津市第二人民医院、上海瑞金医院和浙江省台州医院收集的HBeAg阳性且HBV DNA>2×106 IU/mL未经抗病毒治疗的577例慢性乙型肝炎患者为研究对象。通过肝组织活检确定肝损伤情况，检测血清ALT、AST水平及病毒学指标。分析现有各大指南无创指标特别是HBV DNA载量界值不同的情况下，肝组织免疫耐受状态患者所占比例。进一步尝试以与肝组织免疫病理损伤程度相关性消失时的血清HBV DNA为新的阈值，联合多因素指标建立组织学免疫耐受状态的诊断模型。计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料两组间比较采用χ2检验。采用Spearman法进行相关性分析。采用二元Logistic回归分析建立多因素诊断模型，并应用受试者工作特征曲线下面积（AUC）明确各模型的诊断效能，AUC的比较采用Z检验。 结果 中国2022版、EASL 2017版、AASLD 2018版、APASL 2015版慢性乙型肝炎防治指南病毒学无创指标所鉴定出的免疫耐受状态患者中符合本研究定义（HBV DNA>2×106 IU/mL）的组织学免疫耐受状态的比例分别为47.0%、38.5%、36.0%、44.6%，均未超过50%。当将血清HBV DNA阈值升至>2×108 IU/mL时，尽管免疫介导的肝损伤与HBV DNA相关性消失（r=-0.029，P=0.704），此时肝组织免疫耐受状态患者所占比例也仅为52.0%。在血清HBV DNA>1×108的HBeAg阳性患者队列（n=251）中，显著肝损伤组（n=140）和无显著肝损伤组（n=111）HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT及AST水平比较，差异均有统计学意义（P值均<0.05），进一步多因素二元Logistic回归分析结果显示，AST、HBV DNA、HBeAg是患者组织学免疫耐受状态的独立影响因素（P值均<0.05）。根据以上指标并结合临床，建立预测模型：logit（P）=1.424－0.028×AST，AUC为0.730，AST最佳临界值为30.5 U/L，敏感度和特异度分别为52.8%、84.1%。进一步使用浙江省台州医院接受肝穿刺活检的238例成人慢性HBV感染者作为验证队列，验证结果显示，本研究建立的模型预测效能优于AST/ALT、FIB-4、APRI（AUC分别为0.698、0.555、0.518、0.373，P值均<0.05）。 结论 在HBV DNA>2×108 IU/mL的HBeAg阳性慢性HBV感染者中，AST>30.5 U/L时，提示组织学免疫耐受状态可能被“打破”。 Abstract:Objective The natural history of chronic HBV infection often involves a histologically defined immune tolerance state， and once such immune tolerance state is broken， antiviral therapy should be initiated immediately. This study aims to investigate the correlation between immune-mediated liver injury and virological indicators for HBV and precisely identify the patients with a histologically defined immune tolerance state. Methods This study was conducted among 577 HBeAg-positive chronic hepatitis B （CHB） patients with HBV DNA >2×106 IU/mL who did not receive antiviral therapy in The Fifth Medical Center of PLA General Hospital， Tianjin Second People’s Hospital， Shanghai Ruijin Hospital， and Taizhou Hospital of Zhejiang Province from January 2010 to December 2022. Liver biopsy was performed to determine the extent of liver injury， and the serum levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， and virological indicators were measured. The proportion of patients with a histologically defined immune tolerance state was analyzed based on the cut-off values of noninvasive indicators recommended in various guidelines， especially HBV load. In addition， a diagnostic model was established for the histologically defined immune tolerance state based on serum HBV DNA at the time when its correlation with liver immunopathological injury disappeared as the new threshold in combination with multiple indicators. The Mann-Whitney U test was used for comparison of continuous data between two groups， and the chi-square test was used for comparison of categorical data between two groups. The Spearman method was used for correlation analysis. The binary Logistic regression analysis was used to establish a multivariate diagnostic model； the area under the receiver operating characteristic curve （AUC） was used to investigate the diagnostic efficiency of different models， and the Z test was used for comparison of AUC. Results Among the patients with an immune tolerance state defined by the noninvasive indicators in the Chinese guidelines （2022 edition）， the EASL guidelines （2017 edition）， the AASLD guidelines （2018 edition）， and the APASL guidelines （2015 edition） for the prevention and treatment of CHB， the patients with a histologically defined immune tolerance state who met the definition in this article （HBV DNA>2×106 IU/mL） accounted for 47.0%， 38.5%， 36.0%， and 44.6%， respectively， which did not exceed 50%. When the threshold of serum HBV DNA increased to >2×108 IU/mL， although the correlation between immune-mediated liver injury and HBV DNA disappeared （r=-0.029， P=0.704）， the patients with a histologically defined immune tolerance state reached only 52.0%. In the cohort of 251 HBeAg-positive patients with serum HBV DNA >1×108 IU/mL， there were significant differences in the levels of HBsAg， HBeAg， HBV DNA， ALT， and AST between the significant liver injury group with 140 children and the non-significant liver injury group with 111 patients （all P<0.05）， and the multivariate binary Logistic regression analysis showed that AST， HBV DNA， and HBeAg were influencing factors for histologically defined immune tolerance state in patients （all P<0.05）. Based on the above indicators and related clinical data， a predictive model was established as logit（P）=1.424－0.028×AST， with an AUC of 0.730， an optimal cut-off value of 30.5 U/L， a sensitivity of 52.8%， and a specificity of 84.1%. A total of 238 adult patients with chronic HBV infection who underwent liver biopsy in Taizhou Hospital of Zhejiang Province were enrolled as the validation cohort， and the analysis showed that the predictive model established in this study had a better efficiency than AST/ALT， FIB-4， and APRI， with an AUC of 0.698， 0.555， 0.518， and 0.373， respectively （all P<0.05）. Conclusion For HBeAg-positive patients with chronic HBV infection and HBV DNA>2×108 IU/mL， an AST level of >30.5 U/L might indicate the “breakdown” of histologically defined immune tolerance state. -
Key words:
- Hepatitis B， Chronic /
- Immune Tolerance /
- Diagnosis
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肝性脑病（HE）是肝硬化失代偿期最严重的并发症之一，严重HE一旦发生，则预后不良，病死率高［1］。轻微型肝性脑病（minimal hepatic encephalopathy，MHE）是HE的早期阶段，因此，尽早控制MHE是防止严重HE发生的关键。目前MHE的西医治疗［2］与HE的治疗方法相似，中医则主要是以“醒脑通腑开窍”［3］作为理论基础治疗MHE，既往临床研究证实了灌肠方对于MHE患者降低血氨、改善神志方面显示了良好的疗效［4］；也证明了口服益气养阴解毒化瘀方可以明显改善MHE患者的神经智能测试评分并降低血氨［5］，但是关于中药治疗MHE的作用机制研究很少。根据“肠-肝轴”理论［6］，肝硬化HE与肠道菌群关系密切，肠道菌群的结构和功能改变、肠屏障受损以及小肠细菌过度生长均可以导致血氨及肠道毒素增加，系统性炎症加重，这些毒素通过肠肝循环再次造成肝损伤，肝脏解毒功能下降，更多的血氨及肠道毒素通过血脑屏障入脑，加重了神经炎症和脑水肿。因此，探讨益气养阴扶正解毒化瘀方对于肠道代谢的影响，有助于探索中医药治疗MHE的作用机制。本研究拟通过探索益气养阴解毒化瘀方对于MHE肠道代谢的影响，探讨中药治疗MHE的可能作用机制。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本研究选取2024年3月—2024年5月于本院住院且经肝性脑病心理测量评分（psychometric hepatic encephalopathy score，PHES）诊断为MHE的11例肝硬化患者（MHE组）作为研究对象，同时招募11例健康患者家属（无基础肝病及各种高血压、糖尿病、冠心病、肠道疾病等且BMI正常）作为对照组。
1.2 肝硬化MHE诊断标准
参考《肝硬化肝性脑病诊疗指南》［2］及2014年美国肝病学会和欧洲肝病学会指南［7］，使用PHES测试作为诊断MHE的金标准：PHES测试中的数字连接试验（NCT-A）、数字符号试验（DST）同时阳性可诊断MHE［8］。
1.3 纳入标准
（1）结合生化学、影像学及临床症状，除酒精性肝硬化及肝豆状核变性以外的肝硬化患者；（2）经PHES测试诊断为MHE患者；（3）中医辨证为气阴两虚血瘀证者；（4）BMI在正常范围内；（5）之前未经过MHE的营养治疗和药物治疗。
1.4 排除标准
（1）5年内有过胃肠道大手术及肠道切除手术者；（2）炎症性肠病，肠易激综合征者；（3）持久性、传染性胃肠炎，结肠炎，慢性腹泻原因不明者；（4）慢性便秘者；（5）胃肠道出血及存在历史性胃肠道疾病者；（6）近期使用含碱式水杨酸铋或其他类似药物成分的药物者；（7）取样前1个月内使用过抗生素者；（8）生理期女性。
1.5 研究方法
1.5.1 试剂
益气养阴解毒化瘀方（超纯水浓缩至42%；沙参15 g，麦冬15 g，大黄15 g，厚朴15 g，枳实15 g，赤芍15 g，石菖蒲15 g）（北京康仁堂药业有限公司）；高纯度盐酸甲氧胺、脂肪酸甲酯、无水吡啶、无水硫酸钠（美国圣路易斯公司）；MSTFA（1% TMCS）、甲醇、氯仿、二氯甲烷、己烷、丙酮、乙腈（美国费尔劳恩公司）。
1.5.2 粪便采集方法
分别采集对照组患者、MHE组患者及其经益气养阴解毒化瘀方治疗12周后的粪便。尽量在同一时间采样（考虑人肠道微生物的节律性变化），按照以下程序进行粪便样本的采集：（1）排尽尿液；（2）排便；（3）取样；（4）转运和冷藏。
1.5.3 代谢组学检测的样本制备
采集的粪便样本标记后冻存于-80 ℃的低温冰箱中，将样品在冰浴上解冻，取50 mg粪便样品到1.5 mL离心管中，加入10 μL内标，轻微混匀，加入175 μL预冷的甲醇/氯仿（3∶1混合液）进行提取。将混合物在14 000×g和4 ℃下离心20 min，并在-20 ℃的冰箱中静置20 min，将上清液小心地转移至自动进样玻璃瓶中。放到真空离心浓缩仪中浓缩5 min以除去氯仿，然后转移入低温冷冻干燥机完全冻干。加入50 μL的甲氧胺吡啶溶液，在30 ℃孵育2 h之后，加入50 μL的MSTFA于37.5 ℃孵育1 h。
1.5.4 代谢组学检测
本项目在委托上海麦特绘普公司基于气相色谱飞行时间质谱（GC-TOF/MS）的非靶向代谢学的技术平台XploreMET上检测，采用了Agilent 7890B气相色谱仪，飞行时间质谱系统（美国力可公司）。
1.5.6 GC-TOF/MS 代谢组学数据分析
应用XploreMET软件（V3.0，Metabo-Profile，China）对GC-MS的原始数据进行处理，然后用JiaLab代谢物库进行定性。（1）单变量统计分析，包括t检验、Wilcoxon检验等。（2）多元统计分析，如主成分分析（principal component analysis， PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）法等。
1.6 统计学方法
使用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料两组间比较采用Fisher精确检验；符合正态分布的计量资料以
2. 结果
2.1 基线特征
如表1所示，对照组均为患者家属（生活及饮食习惯基本相同），与MHE组相比，年龄、性别和BMI差异均无统计学意义（P值均>0.05）；与对照组相比，MHE组的NCT-A用时明显延长（P<0.05），DST得分明显减少（P<0.05）。MHE组患者病因为HBV感染6例，HCV感染2例，自身免疫相关肝病3例；Child-Pugh分级为B级3例和C级8例；MELD评分（18.90±5.36）分。
表 1 MHE组和对照组的基线资料Table 1. Baseline characteristics of patients with MHE and control groups项目 MHE组（n=11） 对照组（n=11） 统计值 P值 男/女（例） 8/3 7/4 0.833 年龄（岁） 61.00±11.17 60.00±8.44 t=0.237 0.815 BMI（kg/m2） 20.73±5.26 21.90±5.53 t=-0.513 0.613 NCT-A（s） 68.90±23.00 36.82±15.80 t=3.506 0.002 DST（分） 17.80±4.50 49.18±16.35 t=-6.101 <0.05 2.2 MHE患者肠道微生物代谢分析
2.2.1 MHE患者肠道微生物代谢分类
MHE组和对照组肠道代谢物共检测出235种。MHE组主要组成有氨基酸类41.79%，脂肪酸类15.70%，碳水化合物类16.24%，有机胺类8.96%，有机酸类8.58%，脂类4.00%，其他9.69%。对照组主要组成有氨基酸类36.64%，脂肪酸类22.72%，碳水化合物类16.88%，有机胺类8.29%，有机酸类3.02%，脂类5.8%，其他1.57%。Wilcoxon秩和检验结果显示，MHE组肠道代谢物中的有机酸类明显上升，类苯基丙烷酸类、酚类、维生素类、咪唑类、胆汁酸类明显下降（P值均<0.05）（图1）。
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图 1 MHE组与对照组的主要代谢物分类组成Figure 1. Classification and composition of major metabolites in MHE and control groups2.2.2 MHE患者肠道差异性代谢物分析
2.2.2.1 肠道差异性代谢物单维统计分析
通过Wilcoxon秩和检验来比较两组的差异代谢物，基于单维统计分析筛选出的41种差异代谢物通过火山图显示［阈值设定：
图 2 肠道差异性代谢物的单维统计分析Figure 2. Unidimensional statistical analysis of intestinal differential metabolites2.2.2.2 肠道差异性代谢多维统计分析
基于OPLS-DA模型对MHE组和对照组的差异代谢物进行多维统计分析，采用火山图［阈值设定：代谢物对样本分类的贡献（variable importance in projection，VIP>1）］来展示筛选的差异性代谢物，总共筛到差异代谢物87种（图3）。
注： Corr.Coeffs，代谢物与第一主成分相关性的相关系数。图 3 肠道差异性代谢物的多维统计分析Figure 3. Multidimensional statistical analysis of intestinal differential metabolites2.2.2.3 潜在差异性代谢物的筛选
通过对肠道差异性代谢单维统计分析和多维统计分析结果取交集，对MHE组患者潜在代谢产物进行筛选，筛选标准如下：（1）单维分析P<0.05，
代谢物分类 代谢物 脂肪酸类 柠苹酸 有机胺类 尿素、酪胺 有机酸类 乳酸、甲基丙二酸 氨基酸类 鸟氨酸 碳水化合物类 乳果糖、核糖核酸、木糖内酯、异麦芽糖 苯类 苯基乙胺 醇类 2，3-丁二醇 表 3 17种下调的代谢物Table 3. 17 down-regulated metabolites代谢物分类 代谢物 脂肪酸类 油酸、亚油酸、己二酸、神经酸 有机酸类 酮亮氨酸 有机胺类 亚精胺 氨基酸类 肌氨酸 碳水化合物类 甘油酸、核糖 苯丙酸类 3-（3-羟基苯基）-3-羟基丙酸 维生素类 δ-生育醇、α-生育酚、γ-生育酚 胆汁酸类 二氯乙酸 内脂类 2-油酸单甘油酯 吡啶类 烟酸 咪唑类 咪唑丙烯酸 2.2.2.4 差异性代谢物通路富集分析
对29种差异代谢物进行通路分析，最主要的代谢通路包括：亚精胺和精胺生物合成、尿素循环、甘氨酸和丝氨酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、蛋氨酸代谢、维生素K代谢、a亚麻酸和亚油酸、精氨酸和脯氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、甘油酯代谢、磷酸戊糖通路、氨循环通路、糖原异生、烟酸和烟酰胺代谢、丙酸代谢、组氨酸代谢、丙酮酸代谢、瓦格纳效应、胆汁酸生物合成、酪氨酸代谢。进一步分析发现这些通路主要富集在鸟氨酸循环、支链氨基酸和芳香氨基酸代谢通路中，提示上述通路是MHE患者最重要的代谢通路（图4）。
2.3 益气养阴解毒化瘀方对MHE患者的影响
2.3.1 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肝功能比较
11例MHE患者经益气养阴解毒化瘀方治疗后肝功能指标（ALT、AST、TBil）、血氨指标（NH3）、Child-Pugh评分和MELD评分均较治疗前有明显好转（P值均<0.05）。益气养阴解毒化瘀方治疗前MHE患者的NCT-A用时较治疗后明显缩短（P<0.05），MHE患者的DST得分较治疗前明显增加（P<0.05）（表4）。
表 4 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肝功能的变化Table 4. Changes in liver function before and after treatment with Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription指标 治疗前（n=11） 治疗后（n=11） 统计值 P值 ALT（U/L） 69.65±56.66 17.50±10.87 t=-3.532 0.005 AST（U/L） 53.80（31.90～87.50） 15.70（9.70～21.50） t=-3.513 <0.001 TBil（μmol/L） 72.70（39.90～78.95） 25.50（19.28～30.43） Z=-2.856 0.004 NH3（μmol/L） 43.70±10.96 21.74±6.97 t=5.608 <0.001 Child-Pugh评分（分） 11.36±2.25 6.73±1.62 t=5.551 <0.001 MELD评分（分） 12.50（10.63～17.38） 5.00（2.83～9.67） Z=-3.034 0.002 NCT-A（s） 68.90±23.00 46.18±16.48 t=2.093 0.049 DST（分） 17.80±4.50 23.45±5.43 t=-2.572 0.018 2.3.2 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肠道代谢物组成的比较
MHE患者治疗前后共检测出164种肠道代谢物，从PCA分析（图5）及PLS-DA分析（图6）可见两组代谢物分离良好，提示两组治疗前后代谢物存在明显差异。治疗前代谢物的主要组成为氨基酸类52.89%，有机酸类20.8%，碳水化合物类0.88%、有机胺类14.46%，无机氧化类6.58%，脂肪酸2.81%，其他1.9%；治疗后代谢物的主要组成为氨基酸类20.48%，有机酸类 28.09%，碳水化合物类34.17%、有机胺类3.22%，无机氧化类6.11%，醇类5.22%，其他2.71%。Wilcoxon秩和检验结果显示，与治疗前相比，治疗后MHE患者的醇类、碳水化合物类、内酯类、核苷酸类、有机酸类、酚类、苯丙酸类、吡啶类明显上升，而有机胺类、氨基酸类、苯类、脂肪酸类、吲哚类、多肽类、吡咯烷类明显下降（图7）。
图 5 益气养阴解毒化瘀方治疗前后代谢物的PCA分析Figure 5. PCA analysis of metabolites before and after Yiqi Yangyin Jidu Huayu prescription
图 6 益气养阴解毒化瘀方治疗前后代谢物的PLS-DA分析Figure 6. PLS-DA analysis of metabolites before and after Yiqi Yangyin Jidu Huayu prescription
图 7 益气养阴解毒化瘀方治疗前后的主要代谢物分类组成Figure 7. Classification and composition of main metabolites before and after treatment with Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription2.3.3 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肠道差异性代谢物分析
通过Wilcoxon秩和检验来比较两组的差异代谢物，基于单维统计分析总共筛选出的126种差异代谢物，通过火山图可见，与治疗前相比，治疗后MHE上调代谢物85种，下调代谢物41种（阈值设定：
图 8 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肠道差异性代谢物的单维统计分析Figure 8. Unidimensional statistical analysis of intestinal differential metabolices before and after treatment with Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription
图 9 益气养阴解毒化瘀方治疗前后肠道差异性代谢物的多维统计分析Figure 9. Multidimensional statistical analysis of intestinal differential metabolites before and after treatment with Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription2.3.4 益气养阴解毒化瘀方治疗的潜在代谢标志物筛选
通过对益气养阴解毒化瘀方治疗前后肠道差异性代谢物的单维统计和多维统计分析结果取交集，对MHE潜在代谢产物进行筛选（筛选标准同2.3.4）。共筛选了80种潜在的代谢标志物，经过益气养阴解毒化瘀方治疗后56种代谢物上调，而24种代谢物下调。应用热图（图10）对两组差异性代谢物进行对比分析显示碳水化合物类、有机酸类明显上升，氨基酸类明显下降。而散点图具体展示了经益气养阴解毒化瘀方治疗后上调的56种差异性代谢物和24种下调的差异性代谢物（图11）。
图 10 益气养阴解毒化瘀方治疗前后的差异性代谢物种类热图Figure 10. Heat map of different metabolites before and after treatment of Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription
图 11 益气养阴解毒化瘀方治疗前后的差异性代谢物散点图Figure 11. Scatter diagram of differential metabolites before and after treatment of Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription2.3.5 益气养阴解毒化瘀方治疗前后的差异性代谢物通路分析
对80种益气养阴解毒化瘀方治疗前后的差异代谢通路进行分析，益气养阴解毒化瘀方代谢通路主要富集在半乳糖代谢、谷胱甘肽代谢、同型半胱氨酸降解、乳糖降解、甘氨酸和丝氨酸代谢、丙氨酸循环、甲基组氨酸代谢、尿素循环、蛋氨酸代谢、丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、谷氨酸代谢、甜菜碱代谢、甘油酯代谢、苹果酸-天门冬酸穿梭、半胱氨酸代谢、丙酸代谢、海藻糖降解、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、苯丙氨酸、酪氨酸代谢等通路（图12），这些通路主要富集在鸟氨酸代谢、支链和芳香氨基酸代谢通路中，与MHE患者特异性代谢通路相似，故益气养阴解毒化瘀方很有可能通过改善鸟氨酸代谢及支链氨基酸和芳香氨基酸代谢等途径达到治疗MHE的作用。
图 12 益气养阴解毒化瘀方治疗前后的差异性代谢通路分析Figure 12. Analysis of different metabolic pathways before and after treatment with Yiqi Yangyin Jiedu Huayu prescription3. 讨论
HE是发生在严重肝病基础上，以代谢紊乱为主要病理基础的神经精神异常综合征，是肝疾病常见的并发症及死亡原因之一［9］，严重影响了肝病患者及监护人的生活质量［10］，认知功能损害造成的医疗相关资源消耗远远超过了其他肝硬化并发症［11］。近些年来，中医药治疗MHE取得了良好的疗效［12-14］，然而机制目前尚不明确，本试验开展了中医药对于MHE肠道代谢作用的研究，旨在探索中医药治疗MHE的可能作用机制，为更好地发挥中医药治疗MHE的作用奠定理论基础。
肠道微生态系统是由肠道菌群和肠道微环境构成的庞大复杂的微生态系统［15］。肠道菌群的结构和功能常常会受到肠道微环境等因素的影响，因此本试验在临床中选取了MHE患者服用中药前后的粪便样本进行对比研究。研究发现，MHE患者的肠道代谢物与正常人相比具有明显异常。经过单维和多维统计分析，MHE组和对照组共筛选出29种潜在的代谢标志物，这些差异性代谢物的主要代谢通路富集在鸟氨酸循环、支链氨基酸和芳香氨基酸中。肝脏是鸟氨酸循环重要的代谢器官，在肝损伤严重引起肝功能明显下降时，肝脏无法正常通过鸟氨酸循环进行解毒，故导致血氨增高，使星状胶质细胞合成谷氨酰胺增加，导致细胞变性、肿胀及退行性变，同时可直接影响假性神经递质，引发神经认知功能障碍［16］。肝功能严重受损时，肝脏代谢芳香氨基酸的能力下降，芳香氨基酸主要包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，增多的苯丙氨酸和酪氨酸生成苯乙醇胺和羟苯乙醇胺即假性递质，也是导致HE发生的机制之一。支链氨基酸包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸，是人体必需的氨基酸，这几种氨基酸可以通过血流进入大脑，降低大脑5-羟色胺的产生，支链氨基酸支持大脑合成谷氨酰胺，促进氨的解毒代谢，而且还可以减少过多的芳香族氨基酸进入大脑［17-18］。通过对益气养阴解毒化瘀方治疗前后的肠道代谢物通路分析，发现MHE患者治疗前后差异性代谢物通路与MHE患者特异性代谢通路在鸟氨酸、支链氨基酸、芳香氨基酸代谢方面有交集，说明益气养阴解毒化瘀方有可能是通过鸟氨酸、支链氨基酸和芳香氨基酸代谢通路发挥了改善MHE的作用。
MHE由于起病隐匿，临床中往往不易发现，然而一旦进展为显性HE，则预后不良，因此早期诊断、早期治疗MHE至关重要。中医药在MHE的治疗中发挥了良好的作用，肠道微生态与MHE有着密不可分的联系，通过探索肠道代谢物的变化有助于探讨中医药治疗MHE的作用机制，更好地发挥中医药治疗MHE的作用。本研究首次通过人群队列验证了益气养阴解毒化瘀方可能通过调节MHE患者的相关代谢发挥了治疗作用，但是研究仍然具有一定的局限性，代谢组学研究在统计学上无固定的样本量计算公式，本研究属于小规模的探索性研究，实验样本量仍然较少，目前基于样本量限制，无法进一步针对病因进行分层分析，肠道菌群仍可能受到食物、药物及环境等多种因素的影响，MHE的肠道机制仍需要开展大规模的临床试验和动物实验探索诊断及治疗MHE的肠道生物标记，为早期诊断及治疗MHE提供思路。
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图 1 血清HBV DNA>1×108 IU/mL患者的组织学免疫耐受状态ROC曲线
Figure 1. ROC curves of histologically defined immune tolerance state in patients with serum HBV DNA > 1×108 IU/mL
图 2 血清HBV DNA>2×108 IU/mL患者的组织学免疫耐受状态ROC曲线
Figure 2. ROC curves of histologically defined immune tolerance state in patients with serum HBV DNA > 2×108 IU/mL
图 3 多种无创模型诊断患者组织学免疫耐受状态的ROC曲线
Figure 3. Multiple non-invasive models for diagnosing histologically defined immune tolerance state using ROC curves
表 1 入组患者临床特征
Table 1. Clinical characteristics of the enrolled patients
指标 总计（n=577） 存在显著肝损伤
（n=369）
无显著肝损伤
（n=208）
统计值 P值 年龄（岁） 33（27～39） 33（27～39） 33（27～40） Z=0.156 0.693 性别［例（%）］ χ2=1.255 0.263 男 329（57.02） 204（55.30） 125（60.10） 女 248（42.98） 165（44.70） 83（39.90） ALT（U/L） 52.00（30.00～100.00） 66.00（38.00～142.30） 34.00（25.00～67.70） Z=34.830 <0.001 AST（U/L） 40.00（27.00～66.00） 46.00（32.10～97.00） 29.50（24.00～42.00） Z=38.366 <0.001 HBsAg（log10IU/mL） 4.25（3.76～4.67） 4.06（3.64～4.51） 4.60（4.31～4.84） Z=60.997 <0.001 HBeAg（log10S/CO） 3.09（2.59～3.19） 2.96（2.26～3.15） 3.17（3.09～3.23） Z=50.821 <0.001 HBV DNA（log10IU/mL） 7.84（7.32～8.40） 7.77（7.23～8.22） 8.16（7.58～8.62） Z=26.921 <0.001 
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表 2 各大CHB防治指南定义免疫耐受期的病毒学指标及诊断效能
Table 2. Virological indicators and diagnostic efficacy of the immunotolerant phase defined by the major guidelines for the prevention and treatment of chronic hepatitis B
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表 3 不同HBV DNA截断值肝脏炎症活动度与病毒学指标之间的相关性
Table 3. Correlation between liver inflammatory activity and virological indicators at different HBV DNA cut-off values
变量 HBV DNA
>2×106 IU/mL
（n=577）［r（P）］
HBV DNA
>2×107 IU/mL
（n=438）［r（P）］
HBV DNA
>1×108 IU/mL
（n=251）［r（P）］
HBV DNA
>2×108 IU/mL（n=171）［r（P）］
HBV DNA 肝脏炎症活动度 -0.214（<0.001） -0.219（<0.001） -0.224（<0.001） -0.029（0.704） 肝脏纤维化分级 -0.243（<0.001） -0.122（0.011） -0，106（0.094） 0.054（0.704） ALT -0.049（0.236） -0.035（0.460） 0.044（0.484） 0.090（0.243） AST -0.119（0.004） -0.074（0.123） -0.003（0.968） 0.114（0.137） HBsAg 肝脏炎症活动度 -0.404（<0.001） -0.439（<0.001） -0.424（<0.001） -0.277（<0.001） 肝脏纤维化分级 -0.365（<0.001） -0.306（<0.001） -0.297（<0.001） -0.150（0.070） ALT -0.171（<0.001） -0.235（<0.001） -0.232（<0.001） -0.300（<0.001） AST -0.291（<0.001） -0.360（<0.001） -0.331（<0.001） -0.331（<0.001） HBeAg 肝脏炎症活动度 -0.405（<0.001） -0.445（<0.001） -0.403（<0.001） -0.348（<0.001） 肝脏纤维化分级 -0.411（<0.001） -0.378（<0.001） -0.309（<0.001） -0.219（<0.001） ALT -0.151（<0.001） -0.230（<0.001） -0.287（<0.001） -0.309（<0.001） AST -0.211（<0.001） -0.264（<0.001） -0.328（<0.001） -0.326（<0.001）
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表 4 血清HBV DNA>1×108 IU/mL入组患者的临床特征
Table 4. Clinical characteristics of the enrolled patients with serum HBV DNA>1×108 IU/mL
指标 总计（n=251） 存在显著肝损伤
（n=140）
无显著肝损伤
（n=111）
统计值 P值 年龄（岁） 32（26～39） 31（26～38） 34（26～39） Z=-1.938 0.053 性别［例（%）］ χ2=0.014 0.905 男 155（61.75） 86（61.43） 69（62.16） 女 96（38.25） 54（38.57） 42（37.84） ALT（U/L） 47.50（29.00～97.00） 66.00（37.00～163.00） 34.00（24.00～65.00） Z=-5.616 <0.001 AST（U/L） 37.00（25.00～61.25） 47.00（33.00～90.00） 27.00（22.00～39.00） Z=-6.536 <0.001 HBsAg（log10 IU/mL） 4.61（4.23～4.85） 4.41（4.07～4.75） 4.75（4.55～4.94） Z=-5.432 <0.001 HBeAg（log10 S/CO） 3.15（3.03～3.22） 3.11（2.96～3.18） 3.20（3.14～3.28） Z=-5.268 <0.001 HBV DNA（log10 IU/mL） 8.47（8.23～8.75） 8.35（8.17～8.71） 8.57（8.32～8.86） Z=-3.242 <0.001
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表 5 血清HBV DNA>1×108 IU/mL患者的组织学免疫耐受状态多因素二元Logistic回归分析
Table 5. Multivariate binary Logistic regression analysis of histologically defined immune tolerance state in patients with serum HBV DNA>1×108 IU/mL
自变量 回归系数 Wald χ2 P值 OR 95%CI HBsAg （log10 IU/mL） 0.426 0.661 0.416 1.532 0.548～4.280 HBeAg（log10 S/Co） 1.667 4.564 0.033 5.297 1.144～24.526 HBV DNA（log10 IU/mL） 1.354 7.605 0.006 3.874 1.480～10.145 ALT（U/L） 0.003 0.163 0.687 1.003 0.990～1.016 AST（U/L） -0.054 9.693 0.002 0.948 0.916～0.980
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