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免疫原性细胞死亡基因风险模型的建立及其对肝细胞癌预后和肿瘤微环境特征的预测价值
DOI: 10.12449/JCH241218
Establishment of a risk model based on immunogenic cell death-related genes and its value in predicting the prognosis and tumor microenvironment characteristics of hepatocellular carcinoma
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摘要:
目的 鉴定肝细胞癌（HCC）免疫原性细胞死亡（ICD）相关基因，并基于相关基因构建评分模型预测HCC的预后和肿瘤微环境特征。 方法 通过癌症基因组图谱数据库获取HCC数据集，采用热图展示了HCC中57个ICD相关基因的表达。基于ICD相关基因表达进行聚类分析，对2种ICD相关亚型（ICD低表达组和ICD高表达组）进行基因本体富集、京都基因和基因组百科全书富集、体细胞突变差异、免疫细胞浸润差异分析。构建LASSO Cox回归风险预后模型，验证其临床应用价值。构建列线图模型，预测患者1、3和5年的生存率。此外，采用qRT-PCR验证模型中关键基因的表达水平。两组间比较采用成组t检验，采用单因素和多因素Cox回归分析确定临床病理特征中的预后因素。采用Kaplan-Meier生存曲线进行预后分析。采用Spearman秩相关进行相关性分析。 结果 ICD低表达组预后较差，ICD高表达组与良好的临床结果相关（P=0.004）。进一步研究表明ICD高表达组与免疫活性微环境相关，且ICD高表达组的基因主要富集于免疫相关通路（免疫球蛋白受体结合、造血细胞谱系和B淋巴细胞受体信号通路）。体细胞突变结果显示，ICD高表达组的CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1和PDCD1LG2的基因表达水平较高（P值均<0.05）。利用8个ICD相关基因（HSP90AA1、ATG5、BAX、PPIA、HSPA4、TLR2、TREM1、LY96）建立风险预后模型，该模型在不同临床特征中均有较好的预测价值。单因素和多因素Cox回归分析表明，在训练集中，年龄和风险评分是总生存期的独立预后因素（P值均<0.05）。qRT-PCR结果表明，HSPA4和REM1在HCC肿瘤样本中的相对表达水平显著高于瘤旁组织（P值均<0.001）。ICD风险评分升高的患者与γδT淋巴细胞（r=-0.29）、浆细胞（r=-0.3）和CD8+T淋巴细胞（r=-0.37）呈负相关（P值均<0.05），与记忆B淋巴细胞（r=0.38）、静止树突状细胞（r=0.47）和M0型巨噬细胞（r=0.49）呈正相关（P值均<0.05）。 结论 本研究确定了与HCC预后相关的ICD基因，为理解不同ICD表达谱相关的免疫特性提供了见解。构建的风险模型和列线图对于预测HCC患者的预后预测和免疫治疗指导具有重要的价值。 Abstract:Objective To identify immunogenic cell death （ICD）-related genes in hepatocellular carcinoma （HCC）， and to establish a scoring model based on these genes for predicting the prognosis and tumor microenvironment characteristics of HCC. Methods The Cancer Genome Atlas database was used to obtain HCC datasets， and heatmaps were used to display the expression of 57 ICD-related genes in HCC. A cluster analysis was conducted based on the expression of ICD-related genes， and two ICD subtypes （low and high ICD expression groups） were analyzed in terms of gene ontology enrichment analysis， Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis， somatic mutation， and immune cell infiltration. The LASSO Cox regression risk model was constructed to evaluate its clinical application value， and a nomogram model was established to predict the 1-， 3-， and 5-year survival rates of patients. In addition， qRT-PCR was used to validate the expression levels of key genes in the model. The independent-samples t test was used for comparison between two groups， and the univariate and multivariate Cox regression analyses were used to determine prognostic factors among clinicopathological features. The Kaplan-Meier survival curve was used for prognostic analysis， and the Spearman rank correlation test was used for correlation analysis. Results The low ICD expression group had a poorer prognosis， while the high ICD expression group had relatively favorable clinical outcomes （P=0.004）. Further analysis showed that the high ICD expression group was associated with an immune-active microenvironment， and the genes were mainly enriched in immune-related pathways such as immunoglobulin receptor binding， hematopoietic cell lineage， and B cell receptor. The results of somatic mutation analysis showed that the high ICD expression group had higher expression levels of CD274， CTLA4， HAVCR2， TIGIT， PDCD1， and PDCD1LG2 （all P<0.05）. A risk prediction model was established using 8 ICD-related genes， i.e.， HSP90AA1， ATG5， BAX， PPIA， HSPA4， TLR2， TREM1， and LY96， and this model showed a good predictive value across different clinical characteristics. The univariate and multivariate Cox regression analyses showed that age and risk score were independent prognostic factors for overall survival in the training set （both P<0.05）. The results of qRT-PCR showed that the relative expression levels of HSPA4 and REM1 in HCC tumor samples were significantly higher than those in adjacent tissue samples （both P<0.001）. For the patients with an increase in ICD risk score， the ICD risk score was negatively correlated with γδT cells （r=-0.29， P<0.05）， plasma cells （r=-0.3， P<0.05）， and CD8+T lymphocytes （r=-0.37， P<0.05） and was positively correlated with memory B cells （r=0.38， P<0.05）， resting dendritic cells （r=0.47， P<0.05）， and M0 macrophages （r=0.49， P<0.05）. Conclusion This study identifies the ICD-related genes that are associated with the prognosis of HCC， which provides insights into the immune characteristics of different ICD expression profiles. The risk model and the nomogram model established in this study have a significant value for predicting the prognosis of HCC patients and guiding immunotherapy for HCC patients. -
Key words:
- Carcinoma， Hepatocellular /
- Immunogenic Cell Death /
- Prognosis /
- Tumor Microenvironment
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原发性肝癌是目前全球第六大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第三大常见原因［1］，其中肝细胞癌（HCC）占75%～85%。由于HCC发病隐匿，进展迅速，高达80%的HCC患者在首次诊断时已处于中晚期，5年生存率不足15%［2］。因此，亟需探明HCC发生发展的分子机制，为HCC早期诊断和精准治疗提供靶点。AU富集元件结合因子1（AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1）是真核细胞中重要的转录后调节因子［3］。AUF1通过与mRNA的AU元件富集区结合，调控多种mRNA的稳定性及翻译，其异常表达与炎症、衰老、发育异常和心血管疾病等密切相关［4-6］。AUF1也是一种潜在的致癌因子，在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用［7-8］，但AUF1在肿瘤发生发展中的作用机制尚未完全阐明。本研究利用UALCAN和TCGA-HCC数据库分析AUF1在包括HCC在内的多种肿瘤组织中的表达以及AUF1表达与HCC患者预后的相关性，并分析AUF1对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响及可能机制，以期为阐明AUF1在HCC进展中发挥的作用及分子机制提供依据。
1. 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
siAUF1和对照siNC购自广州锐博生物；pCDH-AUF1及对照质粒（pCDH）为本实验室构建保存；细胞DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；转染试剂Lipo fectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent、Lipo fectamineTM 2000试剂购自美国Invitrogen公司；鼠抗E-cadherin购自美国BD transduction laboratories公司；鼠抗N-cadherin购自美国Santa Cruz公司；兔抗AUF1抗体和兔抗β-cateinin购自英国Abcam公司；鼠抗人β-tubulin抗体和蛋白定量试剂购自北京普利莱公司；兔抗β-actin购自美国CST公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC试剂盒购自日本Dojindo公司。
1.2 肝癌细胞系
HepG2细胞购自美国ATCC细胞库，Huh7和Huh1细胞购自中国科学院上海细胞库。使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、链霉素的DMEM培养基于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达约80%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取生长至对数期的细胞用于实验研究。
1.3 生物信息学分析
采用UALCAN数据库分析AUF1在泛癌中的表达［9-10］；采用TCGA-HCC数据库分析AUF1表达与HCC患者临床病理特征及预后的相关性。
1.4 细胞转染实验
转染前24 h进行细胞传代并计数，按照3.5×105个/孔将细胞接种于6孔板中。按照Lipo fectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent的说明书，将siAUF1或对照siNC转染至HepG2、Huh7或Huh1细胞中。pCDH-AUF1和对照质粒按照Lipo fectamineTM 2000说明书进行转染。转染4～6 h后，更换为新鲜的DMEM完全培养基继续培养，并于转染48 h后收集细胞，用于后续实验研究。
1.5 Western Blot检测
收集细胞沉淀，加入RIPA裂解液进行细胞裂解，使用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭，4 ℃孵育一抗过夜。室温孵育二抗1 h。用美国LI-COR公司Odyssey双色红外激光成像系统采集图像，使用β-tubulin或β-actin作为内参。
1.6 CCK-8实验
在96孔板上以8×103细胞/孔的密度接种细胞。每组设置6个复孔。分别在接种后的0、1、2、3、4、5天在每孔加入含有10 μL CCK-8的100 μL培养基，37 ℃孵育1 h。在450 nm波长下测量吸光度，根据吸光度绘制生长曲线。
1.7 Transwell迁移实验
取得转染24 h后的细胞悬液，PBS清洗去除血清，再用无血清DMEM培养基重悬细胞，将其均匀加入小室中（5×103/200 μL）。在24孔板中加入600 μL含10% FBS的DMEM培养基，镊子夹取小室平稳放入其中，培养36 h。PBS清洗小室及24孔板，经固定、染色后，去除小室中残留的水分及未穿过小室聚碳酸酯膜的细胞。风干，显微镜下拍照。
1.8 细胞凋亡实验
将4×105个细胞/孔置于6孔板中培养48 h，消化离心后弃上清，使用PBS冲洗细胞沉淀2遍，加入300 μL结合缓冲液重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min，并使用流式细胞仪检测。
1.9 RNA测序（RNA-seq）数据分析
本文数据下载自GEO数据库GSE162706数据集［11］。Hisat2［12］和featureCounts［13］用于读图和基因计数计算。edgeR软件［14］用于基因差异表达分析。
1.10 统计学方法
采用FPKM（fragmenls per kilobasemillion）法对TCCA转录组测序数据进行标准化，最终纳入预后分析的HCC样本来自于370例不同病因的HCC患者。使用R语言进行统计学分析及绘图。计量资料两组间比较采用t检验。采用Kaplan-Meier绘图仪数据库（http://www.kmplot.com）评估肝癌患者AUF1表达与无复发生存率之间的关系，并使用Log-rank检验进行生存率比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 AUF1在多种肿瘤组织中异常表达
利用UALCAN数据库分析AUF1在24种肿瘤和相对应正常组织中的mRNA表达情况（图1a）。与正常组织相比，AUF1 mRNA水平在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、胆管癌（CHOL）、结肠癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形性胶质母细胞细胞瘤（GBM）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）、HCC、肺腺癌（LUAD）、肺鳞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、胃癌（STAD）中高表达（P值均<0.05），但在肾嫌色细胞癌（KICH）和甲状腺癌（THCA）中则呈低表达（P值均<0.05）。除此之外，本研究利用UALCAN数据库分析AUF1蛋白在10种肿瘤组织中的表达情况。结果显示，AUF1蛋白在9种肿瘤组织中表达升高（图1b），包括BRCA、COAD、卵巢癌（OV）、肾透明细胞癌（ccRCC）、子宫内膜样癌（UCEC）、肺癌（LUNG）、HNSC、GBM、HCC（P值均<0.05），而在胰腺癌（PAAD）中AUF1蛋白水平降低（P值均<0.05）。综上结果显示，AUF1的mRNA和蛋白水平在HCC、BRCA、COAD、GBM、HNSC中均显著上调，提示AUF1可能在包括HCC在内的多种肿瘤中发挥促癌作用。
注： a，AUF1 mRNA水平；b，AUF1蛋白水平。图 1 AUF1在泛癌组织中的表达水平Figure 1. The expression of AUF1 in pan-cancer2.2 AUF1高表达与HCC患者的不良预后相关
为进一步探究AUF1与肝癌的关系，本研究分析TCGA-HCC数据库中AUF1表达水平与HCC患者临床病理特征的关系。结果显示，AUF1与肿瘤恶性标志物MKI67的表达水平呈正相关（r=0.552 2，P<0.000 1）（图2a）。在不同肝癌Edmondson-Steiner分级中，AUF1 mRNA水平在3级肿瘤中的表达高于1级和2级（P值均<0.000 1）（图2b）。在临床不同TNM分期患者中，AUF1在TNM-Ⅲ期肿瘤组织中的表达水平高于TNM-Ⅰ（P<0.000 1）（图2c）。但无论是Edmondson-Steiner分级还是TNM分期中，4级或TNM-Ⅳ期肝癌组织中AUF1的表达均未见升高。本研究进一步根据TNM分期分别对AUF1表达水平在HCC中的预后能力进行评估。Kaplan-Meier生存分析显示，在早期（Ⅰ～Ⅱ期）肝癌中，AUF1高表达患者的半数生存期仅为30.1个月，显著低于AUF1低表达患者的半数生存期55.87个月（P=0.048）（图2d）。AUF1表达水平与中晚期肝癌（Ⅲ～Ⅳ期）的半数生存期无相关性（P>0.05）。上述结果提示，AUF1的异常表达可能参与HCC的发生和发展，是早期肝癌诊断和预后的潜在标志物。
注： a，AUF1与MKI67 mRNA水平的相关性曲线；b，不同肝癌组织分级中AUF1 mRNA表达水平分析；c，不同TNM分期肝癌组织中AUF1表达水平分析；d，HCC Ⅰ～Ⅱ期中AUF1高表达和低表达患者的生存分析。图 2 AUF1在肝癌组织中的表达及预后分析Figure 2. Expression and prognostic value of AUF1 in patients with HCC2.3 AUF1促进肝癌细胞增殖
为探究AUF1对肝癌细胞增殖能力的影响，本研究在肝癌细胞系中分别敲减或过表达AUF1，并通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力。结果显示，与siNC对照组相比，转染AUF1 siRNA后，HepG2和Huh1细胞中AUF1蛋白水平明显降低（图3a），且敲减AUF1后HepG2和Huh1细胞增殖能力明显低于对照组（图3b）。与敲减结果一致，过表达AUF1的HepG2和Huh7（图3c）细胞增殖能力明显高于pCDH对照组（图3d）。
注： a，Western Blot检测siAUF1的敲减效果；b，CCK-8实验检测AUF1敲减对细胞增殖能力的影响；c，Western Blot检测AUF1的过表达效果；d，CCK-8实验检测AUF1过表达对细胞增殖能力的影响。每24 h检测实验组和对照组在450 nm处吸光度并进行比较。图 3 AUF1对肝癌细胞增殖能力的影响Figure 3. The effect of AUF1 on the proliferation ability of hepatocellular carcinoma cells2.4 AUF1抑制肝癌细胞的凋亡
本研究进一步使用Annexin V/PI双染色法评价AUF1对肝癌细胞凋亡的影响。结果显示，与对照siNC组相比，敲减AUF1后HepG2细胞和Huh1细胞中Annexin V单阳性和Annexin V/PI双阳性细胞比例明显上调，表明细胞的早期和晚期凋亡率增加（图4a）。而在过表达AUF1的HepG2和Huh7细胞中，细胞的早期和晚期凋亡率较pCDH对照组则显著降低（图4b）。
注： a，流式细胞术检测敲减AUF1后HepG2和Huh1细胞的凋亡率；b，流式细胞术检测过表达AUF1后HepG2和Huh7细胞的凋亡率。图 4 AUF1对肝癌细胞凋亡的影响Figure 4. The effect of AUF1 on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells2.5 AUF1抑制肝癌细胞的迁移能力
本研究随后检测AUF1对肝癌细胞迁移能力的影响。Transwell迁移实验结果显示，与对照siNC组相比，AUF1敲减可增强HepG2和Huh1细胞的迁移能力（图5a）。Western Blot检测结果显示，AUF1敲减后E-cadherin水平降低、N-cadherin水平升高（图5b）。与此结果一致，过表达AUF1后Huh7细胞的迁移能力较对照质粒pCDH组降低（图5c），细胞内的E-cadherin蛋白水平升高、N-cadherin蛋白水平降低（图5d）。
注： a，Transwell实验检测AUF1敲减对细胞迁移能力的影响（结晶紫染色，×20）；b，Western Blot检测AUF1敲减对E-cadherin和N-cadherin水平的影响；c，Transwell实验检测AUF1过表达对细胞迁移能力的影响（结晶紫染色，×20）；d，Western Blot检测AUF1过表达对E-cadherin和N-cadherin水平的影响。图 5 AUF1对肝癌细胞迁移能力的影响Figure 5. The effect of AUF1 on the migration ability of hepatocellular carcinoma cells2.6 AUF1通过激活Wnt信号通路发挥促癌作用
为探究AUF1促癌的潜在机制，本研究通过转录组测序（RNA-seq）分析AUF1敲减对HepG2细胞转录组的影响。利用cuffdiff分析模块进行基因差异表达分析，并根据差异倍数和P值进行筛选，共获得467个差异基因。其中162个基因在AUF1敲减后表达上调，305个基因表达显著下调（图6a）。进一步对这些AUF1相关差异基因进行KEGG pathway分析，如结果所示，主要富集在Wnt信号通路、细胞黏附因子、5-羟色氨酸突触、花生四烯酸代谢等多种通路上，其中Wnt信号通路富集到的差异基因数排在前列（图6b）。
注： a，AUF1差异基因分布火山图；b，KEGG pathway富集柱状图，不同颜色代表不同KEGG通路的一级分类，其中黑色代表环境信息处理相关信号通路，灰色代表有机系统相关通路，条纹代表代谢相关通路；c，Western Blot检测β-catenin蛋白水平。图 6 AUF1敲减对肝癌细胞基因功能的影响Figure 6. The effect of AUF1 knockdown on gene function in hepatocellular carcinoma cellsβ-catenin蛋白上调是Wnt通路活化的重要标志。本研究进一步通过Western Blot实验检测肝癌细胞内β-catenin蛋白水平。结果显示，敲减AUF1后HepG2中的β-catenin蛋白下调。而过表达AUF1后β-catenin蛋白上调（图6c）。上述结果提示AUF1可以通过上调β-catenin激活肝癌细胞中的Wnt信号通路。
3. 讨论
AUF1的异常表达与多种肿瘤的发生发展相关，但多数相关研究均基于RNA水平检测，缺少AUF1蛋白水平检测。本研究利用UALCAN数据库，系统分析了泛癌转录组学和蛋白质组学数据中AUF1 mRNA和蛋白在多种肿瘤中的表达情况。本研究发现，与AUF1 mRNA水平一致，AUF1蛋白水平在多种肿瘤组织中亦呈高表达，提示其在这些肿瘤中发挥促癌作用。但在PAAD中，AUF1的mRNA或蛋白水平均降低，提示AUF1的异常表达与不同肿瘤类型有关。
前期通过检测配对的HBV肝癌组织与癌旁组织发现，AUF1在肝癌组织中高表达，并与患者的预后不良有关［15］。本研究利用TCGA-HCC数据库，进一步证实AUF1在肝癌组织中高表达，且其表达水平与MKI67、Edmondson-Steiner分级、TNM分期等多项肿瘤恶性病理学指标正相关。更为重要的是，本研究发现AUF1表达水平随着肝癌分期逐步上调，但在晚期（Ⅳ期）不再继续升高。生存分析结果也显示AUF1对肝癌早期（Ⅰ～Ⅱ期）更有预后价值。体外实验证实AUF1能促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡和迁移。有报道［16］AKR1B10、c-Myc等癌基因在肝癌早期发挥促癌作用，且具有抑制细胞迁移的能力。因此，笔者推测AUF1异常表达可能与肝癌的早期进展有关，是肝癌早期诊断和预后的一个重要指标。
Wnt/β-catenin通路是一种高度保守且严格控制的信号通路，可调节胚胎发育、细胞增殖和分化。越来越多证据表明Wnt信号通路的异常激活促进肝癌增殖［17］。据报道［18］，在约49%的HCC病例中可检测到β-catenin的活化。β-catenin已经被公认为原发性肝癌中最常见的突变基因之一。本研究在HepG2细胞系中敲减AUF1后进行转录组测序，将差异基因进行富集分析，发现差异基因功能富集最显著的是Wnt信号通路，并进一步通过细胞实验证明AUF1激活Wnt通路。本研究发现AUF1敲减后差异基因富集在Wnt通路，Western Blot检测也证实AUF1能够上调β-catenin蛋白水平，提示AUF1通过激活Wnt/β-catenin通路发挥促癌作用。但AUF1激活Wnt通路的具体机制目前尚未明确。笔者团队前期研究发现，AUF1也可以转录后调控AKR1B10、AFP表达。有文献［19］报道AKR1B10在乳腺癌中高表达，并通过激活Wnt/β-catenin通路促进乳腺癌细胞增殖。但在肝细胞癌中，AUF1是否也可通过转录后调控AKR1B10表达进而激活Wnt/β-catenin通路，尚需更多实验验证。
综上所述，本研究证实AUF1在多种肿瘤组织中呈异常表达；AUF1在肝癌组织中的表达水平与肝癌恶性程度以及早期肝癌的不良预后呈正相关；AUF1具有促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡和转移的作用，可能与其激活Wnt信号通路有关。
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注： a，一致性聚类累积分布函数曲线；b，Delta面积图评估不同k值下的聚类稳定性；c，最显著累积分布变化的聚类数目图；d，不同ICD基因表达组热图；e，不同ICD基因表达组患者预后分析。
图 1 ICD低表达组和高表达组分组确定、基因表达热图及预后分析
Figure 1. Group determination， gene expression heatmap， and prognostic analysis of low and high ICD expression groups
注： a，上调基因的GO分析的气泡图；b，上调基因KEGG富集分析的气泡图；c、d，ICD高表达组GSEA分析图。
图 2 ICD高表达组DEG和信号通路的分析
Figure 2. Analysis of differentially expressed genes and signaling pathways in the high ICD expression groups
注： a，ICD高表达组的体细胞突变分析；b，ICD低表达组的体细胞突变分析。
图 3 不同ICD组体细胞突变的比较
Figure 3. Comparison of somatic mutations in different ICD groups
注： a，不同ICD组间免疫评分的比较；b，不同ICD组间基质评分的比较；c，不同ICD组间肿瘤纯净度的比较；d，不同ICD组间免疫细胞含量的比较；e，不同ICD组间免疫检查点的比较；f，不同ICD组间HLA的比较。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图 4 不同ICD组中免疫细胞浸润和免疫微环境的评估
Figure 4. Evaluation of immune cell infiltration and immune microenvironment across different ICD groups
注： a，14个ICD相关预测基因对Cox单变量回归结果的森林图；b，8个ICD相关预后基因的LASSO图；c，HCC患者最佳LASSO模型参数λ的选择；d，高、低风险组患者在训练集合中的Kaplan-Meier生存曲线；e，高、低风险组患者在验证集合中的Kaplan-Meier生存曲线；f，训练集风险评分；g，验证集风险评分；h，训练集OS分布；i，验证集OS分布。
图 5 ICD相关预后基因标记的构建和验证
Figure 5. Construction and validation of ICD-related prognostic gene markers
注： a，临床病理因素与HCC患者OS之间的关系的单因素分析；b，临床病理因素与HCC患者OS之间的关系的多因素分析；c，临床特征和风险评分构建的列线图（远处转移、淋巴结侵犯、肿瘤大小对应TNM分期中的T、N、M）；d，训练和验证队列中列线图预测概率和实际生存率的校准图。
图 6 列线图的构建与评价
Figure 6. Construction and evaluation of the Nomogram
图 7 qRT-PCR检测不同组织HSPA4、TREM1 mRNA 的相对表达水平
Figure 7. Real-time quantitative PCR detection of relative expression levels of HSPA4 and TREM1 mRNA in different tissues
图 8 ICD风险评分与肿瘤微环境细胞的相关性
Figure 8. Correlation between ICD risk score and tumor microenvironment cells
表 1 57个ICD相关基因
Table 1. 57 ICD-related genes
基因 ENTPD1、NT5E、CALR、HMGB1、HSP90AA1、ATG5、BAX、CASP8、CASR、TLR3、TLR7、TLR9、CLEC4E、CLEC7A、DDX58、IFIH1、CGAS、IL1A、IL33、ROCK1、PANX1、BCL2、PPIA、HSPA4、TLR2、AIM2、AGER、TREM1、FPR1、FPR2、P2Y2R、P2Y6R、P2Y12R、IFNA1、CASP1、IL1R1、IL1B、NLRP3、P2RX7、LY96、MYD88、PDIA3、EIF2AK3、PIK3CA、FNB1、CXCR3、IL10、IL6、TNF、TLR4、FOXP3、IFNG、IFNGR1、IL17A、IL17RA、PRF1、HMGN1 
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表 2 HSPA4和TREM1基因的正、反向引物
Table 2. Forward and reverse primers for HSPA4 and TREM1 genes
名称 序列 HSPA4 正向引物：5'-ACCAGGACACTGTTGAGTTC-3' 反向引物：5'-ACTCATCTCCGAGTTCACAC-3' TREM1 正向引物：5'-TGCGGTTGTTTCCTCTCCTGGTCTTG-3' 反向引物：5'-TGTGAAATAGACACCGCTGAAGGTC‑ACT-3'
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