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化痰祛湿活血方对代谢相关脂肪性肝炎大鼠解整合素金属蛋白酶17/髓系细胞触发受体2介导的巨噬细胞胞葬的影响

张丽慧 刘素彤 赵晴 李善政 刘鸣昊 赵文霞

引用本文:
Citation:

化痰祛湿活血方对代谢相关脂肪性肝炎大鼠解整合素金属蛋白酶17/髓系细胞触发受体2介导的巨噬细胞胞葬的影响

DOI: 10.12449/JCH260214
基金项目: 

河南省自然科学基金 (252300420622);

河南省中医药科学研究专项课题 (2022JDZX098);

河南省中医药科学研究专项课题 (2022JDZX006);

河南省中医药科学研究专项课题 (2023ZXZX1051);

国家自然科学基金 (82205086);

河南省中医学“双一流”创建科学研究专项 (HSRP-DFCTCM-2023-7-23)

伦理学声明:本研究方案于2024年5月13日经河南中医药大学实验动物管理委员会批准,批号:IACUC-202405025,符合实验室动物管理与使用准则。
利益冲突声明:本文不存在任何利益冲突。
作者贡献声明:张丽慧负责撰稿及动物实验相关研究;刘素彤负责动物实验相关研究;赵晴负责统计分析;李善政负责部分指标检测;刘鸣昊负责修改稿件;赵文霞负责修改稿件并最终定稿。
详细信息
    通信作者:

    赵文霞,zhao-wenxia@163.com(ORCID: 0000-0001-6666-9469)

Effect of Huatan Qushi Huoxue prescription on macrophage efferocytosis mediated by a disintegrin and metalloproteinase 17 and triggering receptor expressed on myeloid cells 2 in rats with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

Research funding: 

Natural Science Foundation of Henan Province (252300420622);

Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province (2022JDZX098);

Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province (2022JDZX006);

Special Project for Scientific Research of Traditional Chinese Medicine in Henan Province (2023ZXZX1051);

National Natural Science Foundation of China (82205086);

Henan Province Traditional Chinese Medicine “Double First Class” Creation Scientific Research Special Project (HSRP-DFCTCM-2023-7-23)

More Information
  • 摘要:   目的  观察化痰祛湿活血方对代谢相关脂肪性肝炎(MASH)大鼠的治疗效果及作用机制。  方法  选取60只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、模型A组(单纯性脂肪肝模型)、模型B组(MASH模型)、西药组(多烯磷脂酰胆碱,143.64 mg/kg)、中药高剂量组(化痰祛湿活血方,20.16 g/kg)和中药中剂量组(化痰祛湿活血方,10.08 g/kg),每组10只。除空白对照组外,其余各组均给予高脂饲料。模型A组于第8周取材,其余各组于第12周开始每日给药1次,连续8周,模型B组灌胃等体积的生理盐水,于第20周取材。检测大鼠体重、肝湿重、肝指数;采用微板法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和游离脂肪酸(FFA);酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、可溶性髓系细胞触发受体2(sTREM2);苏木精-伊红染色、油红O染色观察肝组织病理变化;免疫荧光法检测肝组织CD68+TREM2+细胞并计算巨噬细胞胞葬率;实时荧光定量聚合酶链反应检测肝组织中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、鞘氨醇1磷酸酯受体1(S1PR1)、解整合素金属蛋白酶17(ADAM17)和髓系细胞触发受体2(TREM2)的mRNA表达水平;免疫组织化学法检测肝组织中S1P、S1PR1、ADAM17和TREM2蛋白表达。符合正态分布的计量资料,方差齐者采用单因素方差分析进行组间比较,进一步两两比较采用LSD-t检验;方差不齐者采用Welch’s检验进行组间比较,进一步两两比较则采用Tamhane’s检验。不符合正态分布的计量资料组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,进一步两两比较采用Dunn’s检验。  结果  与空白对照组比较,模型A组和模型B组的大鼠体重、肝湿重显著升高;模型B组的肝指数显著升高(P值均<0.05)。HE染色结果显示,模型A组大鼠肝组织呈现弥漫性大泡性脂肪变性,模型B组大鼠肝组织显示大量气球样变性肝细胞,小叶内及汇管区可见混合性炎症细胞浸润、轻度窦周纤维化。与空白对照组比较,模型A组、模型B组大鼠NAS、油红O阳性面积显著升高(P值均<0.05);且模型B组大鼠NAS、油红O阳性面积较模型A组显著升高(P值均<0.05)。与空白对照组比较,模型A组、模型B组的血清TC、TG、LDL-C、FFA、IL-1β、IL-6、sTREM2水平均显著升高,血清HDL-C水平显著降低,模型B组的血清ALT、AST和TNF-α水平显著升高(P值均<0.05);且模型B组的血清ALT、AST、TC、TG、FFA、TNF-α、IL-1β、IL-6和sTREM2水平较模型A组显著升高,血清HDL-C水平较模型A组显著降低(P值均<0.05)。免疫荧光法结果显示,与空白对照组比较,模型A组巨噬细胞胞葬率显著升高(P<0.05);模型B组巨噬细胞胞葬率显著低于模型A组(P<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应结果显示,与空白对照组比较,模型A组、模型B组TREM2的mRNA水平显著升高(P值均<0.05),模型B组S1P、S1PR1的mRNA水平显著升高(P值均<0.05);且模型B组S1PR1、TREM2的mRNA水平较模型A组升高(P值均<0.05)。免疫组织化学法结果显示,与空白对照组比较,模型A组和模型B组S1P、S1PR1、ADAM17蛋白表达水平显著升高,模型A组TREM2蛋白表达水平显著升高(P值均<0.05);且模型B组S1P、S1PR1和ADAM17蛋白表达水平较模型A组升高,TREM2蛋白表达水平较模型A组显著降低(P值均<0.05)。与模型B组比较,各用药组大鼠体重、肝湿重和肝指数显著降低(P值均<0.05);各用药组肝组织脂肪变及炎症损伤改善明显,NAS及油红O阳性面积显著降低(P值均<0.05);血清ALT、AST、TC、TG、FFA、IL-1β、IL-6水平显著降低(P值均<0.05),血清HDL-C水平显著升高(P<0.05),中药高剂量组血清TNF-α水平显著降低(P<0.05);各用药组巨噬细胞胞葬率显著升高(P值均<0.05);中药高剂量组、中药中剂量组ADAM17蛋白表达水平显著降低,中药高剂量组TREM2蛋白表达水平显著升高(P值均<0.05)。  结论  化痰祛湿活血方改善MASH大鼠肝脂质代谢及炎症水平可能与调控肝脏巨噬细胞胞葬有关。

     

  • 图  1  各组大鼠肝组织病理

    Figure  1.  Pathology of liver tissue in each group of rats

    注: TREM2,髓系细胞触发受体2。

    图  2  各组大鼠巨噬细胞胞葬率结果(免疫荧光,×200)

    Figure  2.  Phagocytic rate of macrophages in each group of rats (immunofluorescence,×200)

    注: S1P,鞘氨醇-1-磷酸;S1PR1,鞘氨醇1磷酸酯受体1;ADAM17,解整合素金属蛋白酶17;TREM2,髓系细胞触发受体2。

    图  3  各组大鼠巨噬细胞胞葬相关蛋白S1P、S1PR1、ADAM17、TREM2的表达结果(免疫组化,×200)

    Figure  3.  Expression of macrophage cell burial related proteins S1P, S1PR1, ADAM17 and TREM2 in each group of rats (immunohistochemistry, ×200)

    表  1  引物序列

    Table  1.   Primer information

    基因 引物序列(5'-3') 碱基数
    GAPDH
    上游
    下游
    CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG
    GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
    22
    21
    S1P
    上游
    下游
    TCATCACGTCCCCTGAAAAGAG
    CAAAAACAGCAACCCTGACATTAG
    22
    24
    S1PR1
    上游
    下游
    GCTGAACATCGGAGTGGAGAAG
    GAGCCACAAACATACTTCCTTCC
    22
    23
    TREM2
    上游
    下游
    CCAAGCCCTCAACACCACA
    ACCGTGCTCCCATTCTGCTT
    19
    20
    ADAM17
    上游
    下游
    AAGGGATCTACAGTCTGCGACA
    CCTAGAGTCAGGCTCACCAACC
    22
    22

    注:GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶;S1P,鞘氨醇-1-磷酸;S1PR1,鞘氨醇1磷酸酯受体1;TREM2,髓系细胞触发受体2;ADAM17,解整合素金属蛋白酶17。

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    表  2  各组大鼠体重、肝湿重、肝指数

    Table  2.   Rat weight, liver wet weight, and liver index of each group of rats

    组别 动物数(只) 体重(g) 肝湿重(g) 肝指数(%)
    空白对照组 10 542.80±27.48 16.23±1.27 2.99±0.22
    模型A组 10 593.50±10.461)2) 20.43±2.551)2) 3.45±0.462)
    模型B组 10 742.70±79.011) 39.80±10.461) 5.30±0.951)
    西药组 10 622.50±62.622) 22.23±2.522)3) 3.57±0.222)
    中药高剂量组 10 583.60±21.022) 18.68±1.902) 3.20±0.282)
    中药中剂量组 10 602.80±51.712) 22.09±3.462) 3.67±0.512)
    F 12.954 20.209 15.394
    P <0.01 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。

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    表  3  各组大鼠肝组织染色结果

    Table  3.   Staining results of liver tissue in each group of rats

    组别 动物数
    (只)
    肝细胞脂肪变

    小叶内炎症
    (20倍计数坏死灶)

    肝细胞气球样变 NAS(分) 油红O阳性面积
    (%)
    空白对照组 5 1.00(1.00~1.50) 0.00(0.00~0.00) 0.00(0.00~0.50) 1.40±0.55 3.70±0.40
    模型A组 5 2.00(2.00~3.00) 0.00(0.00~0.00)2) 0.00(0.00~1.00)2) 2.80±0.841)2) 17.44±3.081)2)
    模型B组 5 3.00(3.00~3.00)1) 1.00(1.00~2.00)1) 2.00(1.50~3.00)1) 6.60±1.141) 61.91±2.281)
    西药组 5 2.00(2.00~3.00) 1.00(1.00~1.50) 1.00(1.00~2.00) 5.00±0.712)3) 27.36±1.852)3)
    中药高剂量组 5 2.00(1.50~2.00) 0.00(0.00~1.00) 1.00(1.50~1.00) 3.00±1.002) 18.66±2.182)
    中药中剂量组 5 2.00(1.50~2.50) 1.00(1.00~1.50) 1.00(1.00~2.00) 4.20±1.642) 29.51±1.632)3)
    统计值 H=17.690 H=118.964 H=118.495 F=115.538 F=1450.275
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。

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    表  4  各组大鼠血清肝脏酶学、血脂水平

    Table  4.   Serum liver enzyme and blood lipid levels of rats in each group

    组别 动物数
    (只)
    ALT
    (U/L)
    AST
    (U/L)
    TC
    (mmol/L)
    TG
    (mmol/L)
    HDL-C
    (mmol/L)
    LDL-C
    (mmol/L)
    FFA
    (mmol/L)
    空白对照组 10 20.24±8.82 22.85±7.83 2.03±0.22 0.77±0.21 2.40±0.70 0.65±0.21 0.94±0.55
    模型A组 10 26.25±10.072) 24.63±8.362) 3.68±0.411)2) 1.36±0.131)2) 1.18±0.331)2) 1.85±0.441) 2.38±0.591)2)
    模型B组 10 162.36±37.601) 46.11±8.891) 6.45±1.451) 2.12±0.571) 0.58±0.181) 1.88±0.731) 5.73±2.101)
    西药组 10 58.07±16.702)3) 34.26±14.572)3) 3.34±0.542) 1.10±0.372) 1.28±0.342)3) 1.56±0.81 2.36±0.652)3)
    中药高剂量组 10 33.70±11.712) 21.31±6.382) 2.73±0.482) 0.87±0.272) 2.13±0.592) 1.04±0.29 1.14±0.722)
    中药中剂量组 10 59.97±13.122) 33.41±10.872) 3.57±0.642) 1.27±0.512) 0.95±0.132)3) 1.08±0.38 2.52±0.632)3)
    F 37.111 9.158 44.310 17.883 25.613 15.462 17.479
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。ALT,丙氨酸氨基转移酶;AST,天冬氨酸氨基转移酶;TC,总胆固醇;TG,甘油三酯;HDL-C,高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C,低密度脂蛋白胆固醇;FFA,游离脂肪酸。

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    表  5  各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、sTREM2水平

    Table  5.   Serum TNF-α, IL-1β, IL-6 and sTREM2 levels in each group of rats

    组别 动物数
    (只)
    TNF-α
    (pg/mL)
    IL-1β
    (pg/mL)
    IL-6
    (pg/mL)
    sTREM2
    (ng/mL)
    空白对照组 10 229.18±104.00 97.03±21.08 26.42±6.20 7.21±0.71
    模型A组 10 316.47±45.692) 203.71±31.491)2) 57.24±11.691)2) 8.66±0.601)2)
    模型B组 10 808.13±164.831) 355.85±57.041) 120.96±40.591) 21.13±1.961)
    西药组 10 601.78±112.253) 267.74±48.802)3) 61.83±19.492) 18.52±3.303)
    中药高剂量组 10 371.56±64.322) 197.96±37.522) 37.41±11.592) 11.20±1.442)
    中药中剂量组 10 601.12±231.133) 249.31±56.642)3) 63.11±36.342)3) 13.71±1.542)3)
    F 29.504 38.013 24.509 115.212
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。TNF-α,肿瘤坏死因子-α;IL-1β,白细胞介素-1β;IL-6,白细胞介素-6;sTREM2,可溶性髓系细胞触发受体2。

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    表  6  各组大鼠巨噬细胞胞葬率

    Table  6.   The phagocytic rate of macrophages in each group of rats

    组别 动物数(只) 巨噬细胞胞葬率(%)
    空白对照组 5 11.55±2.30
    模型A组 5 51.42±1.901)2)
    模型B组 5 15.14±1.69
    西药组 5 19.21±2.052)3)
    中药高剂量组 5 49.65±5.822)
    中药中剂量组 5 27.07±4.592)3)
    F 129.133
    P <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。

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    表  7  各组大鼠肝组织S1P、S1PR1、ADAM17、TREM2 mRNA表达水平

    Table  7.   The mRNA levels of S1P, S1PR1, ADAM17, and TREM2 in liver tissues of rats in each group

    组别 动物数(只) S1P S1PR1 ADAM17 TREM2
    空白对照组 6 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00
    模型A组 6 2.91±1.13 2.60±1.082) 2.63±1.34 2.84±0.601)2)
    模型B组 6 6.73±2.331) 7.11±2.981) 7.93±3.68 7.16±0.931)
    西药组 6 5.90±0.70 6.34±2.47 5.61±1.90 6.76±1.37
    中药高剂量组 6 5.94±2.14 8.20±7.41 3.03±1.04 8.50±1.87
    中药中剂量组 6 5.90±1.86 6.70±3.39 4.45±1.49 6.58±1.42
    F 12.058 3.536 9.710 34.864
    P <0.01 <0.05 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05。S1P,鞘氨醇-1-磷酸;S1PR1,鞘氨醇1磷酸酯受体1;ADAM17,解整合素金属蛋白酶17;TREM2,髓系细胞触发受体2。

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    表  8  各组大鼠肝组织S1P、S1PR1、ADAM17、TREM2蛋白表达水平

    Table  8.   Expression levels of S1P, S1PR1, ADAM17, and TREM2 proteins in liver tissues of rats in each group

    组别 动物数(只) S1P S1PR1 ADAM17 TREM2
    空白对照组 5 6.24±0.87 3.43±0.90 5.00±1.01 5.24±0.30
    模型A组 5 11.87±1.771)2) 8.21±0.781)2) 13.26±1.721)2) 34.15±9.151)2)
    模型B组 5 22.47±2.961) 35.42±7.861) 26.31±1.801) 8.52±2.27
    西药组 5 20.72±1.46 30.95±3.53 22.54±2.393) 9.38±2.20
    中药高剂量组 5 20.99±1.37 33.77±5.14 15.37±1.322) 22.74±5.662)
    中药中剂量组 5 22.42±2.57 31.25±3.93 20.57±1.422)3) 15.02±2.91
    F 59.345 50.987 129.890 27.657
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与模型B组比较,2)P<0.05;与中药高剂量组比较,3)P<0.05。S1P,鞘氨醇-1-磷酸;S1PR1,鞘氨醇1磷酸酯受体1;ADAM17,解整合素金属蛋白酶17;TREM2,髓系细胞触发受体2。

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出版历程
  • 收稿日期:  2025-09-01
  • 录用日期:  2025-10-29
  • 出版日期:  2026-02-25
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