肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，其发病率在所有恶性肿瘤中排第6位，致死率排第4位，世界卫生组织估计，截至2030年，全球每年将有超过100万死于HCC的患者^[1-2]。由于HCC起病隐匿，进展迅速且异质性高，尽管外科手术、射频消融、化学栓塞甚至肝移植已广泛用于HCC治疗，但HCC患者的存活率仍然较低^[3-4]。由于与HCC发生和发展有关的生物学过程非常复杂，迄今为止尚无敏感高效的预后生物标志物，因此，有必要探索新的能够高效预测HCC预后的生物标志物或模型，用于HCC的诊断、预后和治疗。

微RNA(microRNA, miRNA)是一类参与mRNA转录后调控的非编码小RNA，通过与目标mRNA的3′非编码区结合，抑制转译或降解mRNA，继而在转录后水平调控靶基因的表达，从而影响细胞生物学功能，miRNA的差异表达在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥关键作用^[5-6]，而且多项研究^[7-9]已经确定miRNA模型能够预测恶性肿瘤患者的预后，比如乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌。而在本次研究中，首先从TCGA中下载HCC基因及临床数据，随后找出与HCC预后相关的miRNA，构建预测HCC预后的miRNA风险评分模型，并验证其检验效能。

1.   资料与方法

1.1   数据下载与整理

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载HCC miRNA转录组数据及临床数据。

1.2   差异分析

利用R语言的limma包对HCC与正常肝组织之间的miRNA进行基因差异表达对比分析，并设置差异倍数log2FC(fold change，FC)＞1.0且P＜0.01。

1.3   miRNA风险评分模型的构建

从临床数据中提取生存信息，包括生存时间和生存状态，与差异表达的miRNA进行整合，利用R语言caret包将其随机分成训练集和测试集，利用survival、glmnet、survminer包对训练集进行单因素Cox回归分析，并设定P＜0.01为差异具有统计学意义。然后通过10倍交叉验证的LASSO-Cox回归分析进一步筛选预后miRNA，并计算每个miRNA的危险比(HR)和回归系数，基于miRNA表达水平及回归系数的线性组合构建与HCC预后相关的风险评分模型。

1.4   miRNA风险评分模型的验证

根据风险评分模型计算出训练集中每个样本的风险得分，并根据中位风险得分值将样本分为高风险组和低风险组，采用log-rank检验的Kaplan-Meier生存曲线评估高风险组与低风险组的预后差异，组间差异比较时设定P＜0.05为差异具有统计学意义，同时在测试集中评估其稳健性。为了评估该模型是否可以预测同一临床分期的患者预后，对不同TNM分期的患者进行了分层分析，将HCC患者分为低TNM组(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM组(Ⅲ和Ⅳ期)，同样采用log-rank检验的Kaplan-Meier生存曲线评估高TNM组和低TNM组的预后差异，并设定P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.5   miRNA风险评分模型的评估

通过R语言的survival ROC包绘制ROC曲线，计算出ROC曲线下面积(AUC)，并与传统TNM分期比较，评估该模型的预测准确性，其中AUC＞0.7被认为具有良好的预测效能。最后对风险评分模型和临床特征进行单因素和多因素Cox回归分析评估该模型预后独立性，并设定P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   一般资料

miRNA样本共425例，包括375例HCC样本及50例癌旁样本，并将临床数据中生存时间、生存状态及TNM分期缺失的数据删除，获得临床数据352例(表 1)。

表  1  TCGA数据库HCC患者的临床数据

项目	数值[例(%)]
生存状态
存活	234(66.5)
死亡	118(33.5)
性别
女性	112(31.8)
男性	240(68.2)
年龄
＜60岁	166(47.2)
≥60	186(52.8)
肿瘤分级
G1	46(13.1)
G2	171(48.6)
G3	120(34.1)
G4	13(3.7)
未知	2(0.5)
TNM分期
Ⅰ	175(49.7)
Ⅱ	86(24.4)
Ⅲ	86(24.4)
Ⅳ	5(1.5)
T分期
T1	176(50.0)
T2	88(25.0)
T3	77(21.9)
T4	10(2.8)
未知	1(0.3)
M分期
M0	269(76.4)
M1	4(1.2)
未知	79(22.4)
N分期
N0	257(73.0)
N1	4(1.2)
未知	91(25.8)

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2.2   差异表达的miRNA

利用R语言对HCC及癌旁组织进行miRNA差异表达分析，以log2FC＞1.0且P＜0.01为标准，共筛选出300个差异表达miRNAs，上调基因260个，下调基因40个。

2.3   miRNA风险评分模型的构建

将差异表达的miRNA与临床数据进行整合匹配，共得到347个样本，利用R语言将其按照1∶ 1随机分成训练集(n=175)和测试集(n=172)，对训练集依次进行单因素Cox及10倍交叉验证的LASSO-Cox回归分析。单因素Cox回归分析显示，23个miRNAs与HCC预后相关(P＜0.01)。然后通过LASSO回归进一步筛选miRNA，结果显示9个miRNAs: hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-4652-5p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-122b-5p、hsa-miR-3677-5p、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p与HCC预后显著相关(图 1)。

图  1  LASSO回归构建miRNA模型

注：a，LASSO筛选与生存相关的miRNAs；b，与HCC患者预后相关的miRNAs的LASSO系数。

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最后将LASSO回归筛选出的miRNAs拟合到多因素Cox回归分析，最终确定了包括hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa- miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p在内的6个miRNAs，构建风险评分公式并绘制森林图(图 2)。风险评分公式：hsa-miR-139- 5p×(-0.001 07)+hsa-miR-1180-3p×0.001 57+hsa-miR-1269b×0.000 26+hsa-miR-3680-3p×0.162 79 +hsa-miR-509-3-5p×0.002 46+hsa-miR-31-5p×0.010 67，计算每个样品的风险得分。在这些miRNAs中，hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的系数为正，表明这些基因表达水平越高，生存期越短，而hsa-miR-139-5p的系数为负，表明该基因表达水平越高，生存期越长。

图  2  6个miRNAs危险比(HR)的森林图

注：**, P＜0.01；***, P＜0.001。

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2.4   miRNA风险评分模型的验证

根据miRNA风险评分模型，计算训练集中每个样本的风险得分，再根据中位风险得分值(n=0.918 637 4)将训练集分为高风险组(n=87)和低风险组(n=88)。生存曲线显示(图 3a)高风险组患者的生存率明显低于低风险组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。同样地，根据相同的风险评分模型及中位风险得分值(n=0.918 637 4)，将测试集中的患者分为高风险组(n=81)和低风险组(n=91)，生存曲线显示(图 3b)，高风险组患者的生存率明显低于低风险组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图  3  高风险组和低风险组的Kaplan-Meier生存分析

注：a，训练集生存曲线；b，测试集生存曲线。

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随后根据样本的风险得分排名，分别绘制训练集和测试集的风险图、生存状态图及与HCC预后相关的6个miRNAs的风险热图(图 4、5)。结果表明高风险评分的患者预后较差，且系数为正的miRNAs(hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3 680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p)表达上调，而低风险评分的患者预后较好，且系数为负的miRNA(hsa-miR-139-5p)表达上调。

图  4  训练集风险评分分析(扫描二维码查看原图)

注：a，训练集风险图；b，训练集生存状态图；c，训练集风险热图

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图  5  测试集风险评分分析(扫描二维码查看原图)

注：a，测试集风险图；b，测试集生存状态图；c，测试集风险热图。

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将患者按TNM分期分为低TNM组(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM组(Ⅲ和Ⅳ期)，Kaplan-Meier曲线显示低TNM组、高TNM组的高风险患者的生存率显著低于低风险患者(P＜0.05)，表明该模型可以预测同一临床分期的患者预后。

2.5   miRNA风险评分模型的评估

利用R语言绘制miRNA模型及TNM分期的ROC曲线并计算AUC，结果显示训练集(图 7a)中，miRNA模型及TNM分期的AUC分别为0.817、0.667，测试集(图 7b)分别为0.808、0.665，及合集样本(图 7c)分别为0.814、0.663，miRNA模型预测准确性均优于TNM分期。

图  6  不同亚组的Kaplan-Meier生存分析

注：a，低TNM组(Ⅰ和Ⅱ期)生存曲线；b，高TNM组(Ⅲ和Ⅳ期)生存曲线。

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图  7  miRNA模型和TNM分期的ROC曲线

注：a，miRNA模型和TNM分期在训练集的ROC曲线；b，miRNA模型和TNM分期在测试集的ROC曲线；c，miRNA模型和TNM分期在合集的ROC曲线。

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将年龄、性别、肿瘤分级、TNM分期、miRNA评分分别进行单因素、多因素Cox独立预后分析，单因素分析结果显示T分期、M分期、TNM分期及miRNA评分是HCC患者预后的相关因素(P值均＜0.05)(图 8a)，多因素分析结果显示miRNA评分模型可作为HCC的独立预后因子(P＜0.05)(图 8b)。

图  8  临床特征与风险得分的独立预后分析

注：a，单因素分析；b，多因素分析。

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3.   讨论

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，在各个年龄段均可发病，发病率和死亡率比较高，预后很差。目前，用于预测HCC预后主要依据传统的TNM分期^[10]，尽管TNM分期在恶性肿瘤的诊断和治疗中起着重要作用，但由于肿瘤的异质性和个体差异，其无法反映内部的生物学过程和疾病进展，因此有必要寻找一种新的能够高效预测HCC预后的生物标志物或模型，辅助临床工作。

在本次研究中，首先从TCGA中下载HCC的miRNA表达量及临床数据，TCGA是由美国国立卫生研究院支持发起的，包括30多种癌症，旨在提供不同癌症的全面基因分析并建立与临床结果的相关性，这些数据对于癌症的研究具有巨大的潜力，并且已经利用这些数据取得了许多成果^[11-16]。当作者试图从训练集中确定预后特征时，由于样本量小，基因数量众多，因此对训练集中的数据进行了10倍交叉验证的LASSO-Cox回归分析。其中LASSO是一种创新的回归变量选择方法，在系数的绝对值之和小于一个常数的情况下将残差平方和最小化，从而使某些回归系数严格等于0，从而选择出对因变量影响较大的自变量，是通过构造一个惩罚函数得到一个较为精炼的模型^[17]，从而减少模型的过度拟合。而交叉验证法是比较常用的推测估计惩罚系数λ的方法，而λ值最终是由使平均交叉验证误差最小的最小化λ确定的。然后根据Cox多因素回归分析，得出和HCC预后相关的6种miRNAs。通过回顾已发表的文献^[18-20]，作者发现miRNA的失控与HCC的发生、耐药、预后相关，广泛参与HCC中肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。其中hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的表达在HCC组织中上调，可能起致癌作用，hsa-miR-139-5p在HCC组织中的表达下调，可能起抑癌作用，而hsa-miR-139-5p可以通过减少SLITRK4的表达抑制HCC细胞的生长^[21]。然后基于回归系数构建了风险评分模型，计算出训练集中每位患者的风险得分，然后根据中位风险得分值将其分为高风险组和低风险组，并在测试集中验证了该miRNA风险评分模型的预后价值。生存曲线分析表明，训练集、测试集的高风险组和低风险组的生存曲线均观察到明显的分离(P值均＜0.05)。为了检验该模型预测效能，绘制了ROC曲线，并计算了相应的AUC，将其与传统TNM分期比较，结果显示在训练集、测试集及合集样本中miRNA模型的预测准确性均优于TNM分期。最后将年龄、性别、分级、分期、miRNA评分模型分别进行单因素、多因素Cox独立预后分析，结果显示该miRNA评分模型可作为HCC的独立预后因子。该模型与传统TNM分期相比较，能够更好地反应内在生物学进程和疾病进展，受主观因素影响少，且该预测模型具有可评估性和可重复性等优点，可与传统TNM分期互补，共同应用于临床工作。同时本研究也有一定的不足，所有分析均通过TCGA数据库完成，以后可同时设置内部验证集和外部验证集(如GEO数据库)验证该模型预测准确性，而且未进行相关实验，这些都有待进一步研究工作。