黄芪甲苷通过调控宿主核糖体翻译开关抑制HBV复制的机制
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.07.009
Mechanism of astragaloside Ⅳ inhibits hepatitis B virus replication by regulating host ribosome translation process
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摘要:
目的 分析黄芪甲苷抑制HBV复制的宿主调控机制。 方法 使用不同浓度的黄芪甲苷处理人正常肝细胞(L-02),根据黄芪甲苷浓度的不同,分为0、5、10和20 μg/mL 4组。应用CCK-8检测细胞活性,流式细胞法检测细胞凋亡,化学发光和生化方法检测AFP、ALT、AST和ALP外泌水平,评估黄芪甲苷对正常细胞的影响。用黄芪甲苷处理携带HBV的肝癌细胞Hep3B,应用qPCR方法检测HBV DNA、pgRNA、MTIF2、RPL10基因表达量,ELISA测法检测HBsAg和HBeAg,评估对HBV复制的影响。应用TCGA和GEO数据库结合R语言资料包对RPL10和MTIF2在临床样本中的预后影响进行分析验证。绘制Kaplan-Meier生存曲线,log-rank检验用于分析比较两组或多组之间的生存差异,进行了time ROC分析以比较RPL10和MTIF2基因的预测准确性和风险评分。计量资料多组间比较和同一组内不同时间段比较均采用单因素方差分析,进一步分析两两组间比较采用Bonferroni方法。 结果 20 μg/mL组处理24 h和48 h相较未处理组细胞生长活性均显著提高(P值均<0.05),20 μg/mL组处理72 h相较10 μg/mL组生长活性提高(P<0.05),5 μg/mL组处理72 h相较未处理组生长活性提高(P<0.05)。5、10和20 μg/mL 3个处理组AFP水平均较未处理组显著增高(P值均<0.05),10和20 μg/mL 2个处理组ALT水平分别均较未处理和5 μg/mL 2组显著降低(P值均<0.05),20 μg/mL组ALT水平较10 μg/mL组显著降低(P<0.05)。5、10和20 μg/mL 3个处理组AST水平较未处理组均显著增高(P值均<0.05)。5、10和20 μg/mL 3个处理组HBV DNA、pgRNA、HBsAg、HBeAg、RPL10和MTIF2水平与未处理组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。生物信息学分析结果显示,HBV感染的肝癌患者中RPL10和MTIF2基因较高水平表达的患者预后较差,而在无HBV感染的肝癌患者中不存在此现象。 结论 黄芪甲苷能够抑制翻译起始蛋白MTIF2和核糖体大亚基成分RPL10,通过调控宿主核糖体翻译开关降低HBV复制。 Abstract:Objective To investigate the host regulatory mechanism of astragaloside Ⅳ in inhibiting hepatitis B virus (HBV) replication. Methods Normal human hepatocytes L-02 were treated with different concentrations of astragaloside Ⅳ, and according to the concentration of astragaloside Ⅳ, the cells were divided into 0, 5, 10, and 20 μg/mL groups. CCK-8 assay was used to measure cell viability, flow cytometry was used to measure cell apoptosis, and chemiluminescence and biochemical methods were used to measure the levels of alpha-fetoprotein (AFP), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP), so as to evaluate the influence of astragaloside Ⅳ on normal cells. Hepatoma cells Hep3B carrying HBV were treated with astragaloside Ⅳ; quantitative PCR was used to measure the mRNA expression levels of HBV DNA, pgRNA, MTIF2, and RPL10, and ELISA was used to measure the levels of HBsAg and HBeAg, so as to evaluate the effect of astragaloside Ⅳ on HBV replication. TCGA and GEO databases combined with R language package were used to analyze the prognostic effect of RPL10 and MTIF2 in clinical samples. The Kaplan-Meier method was used for survival analysis, and the log-rank test was used for comparison of survival between two or multiple groups; the time-dependent ROC curve analysis was performed to compare the predictive accuracy and risk score of RPL10 and MTIF2 genes. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups and within each group at different time points, and the Bonferroni method was used for further comparison between two groups. Results Compared with the untreated group, the 20 μg/mL group had a significant increase in cell growth activity at 24 and 48 hours of treatment (both P < 0.05); compared with the 10 μg/mL group, the 20 μg/mL group had a significant increase in cell growth activity at 72 hours of treatment (P < 0.05); compared with the untreated group, the 5 μg/mL group had a significant increase in cell growth activity at 72 hours of treatment (P < 0.05). Compared with the untreated group, the 5, 10, and 20 μg/mL groups had a significant increase in AFP (all P < 0.05); compared with the untreated group and the 5 μg/mL group, the 10 and 20 μg/mL groups had a significant reduction in ALT (all P < 0.05), and compared with the 10 μg/mL group, the 20 μg/mL group had a significant reduction in ALT (P < 0.05). Compared with the untreated group, the 5, 10, and 20 μg/mL groups had a significant increase in AST (all P < 0.05). There were significant differences in the levels of HBV DNA, pgRNA, HBsAg, HBeAg, RPL10, and MTIF2 between the 5/10/20 μg/mL groups and the untreated group (all P < 0.05). The bioinformatics analysis showed that among the liver cancer patients with HBV infection, the patients with high mRNA expression levels of RPL10 and MTIF2 genes tended to have a poor prognosis, while this phenomenon was not observed in liver cancer patients without HBV infection. Conclusion Astragaloside Ⅳ can inhibit the translation initiation factor MTIF2 and the large ribosomal subunit RPL10 and reduce HBV replication by regulating the initiation of host ribosome translation. -
Key words:
- Astragaloside Ⅳ /
- Hepatitis B virus /
- Ribosomal Proteins
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第六大常见肿瘤和我国第二大癌症死亡原因,早期发现、及时采取有效的治疗是改善患者生存预后的重要手段[1-2]。射频消融术(radiofrequency ablation,RFA)在早期肝癌特别是直径≤2 cm的患者中的疗效与手术切除相当,是不能切除的早期肝癌患者的首选治疗方法[3-6]。许多临床和实验研究[7-8]表明,全身炎症反应在肿瘤的进展中发挥重要作用。近年来,多项研究[9-11]证实了全身炎症标志物包括中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、红细胞分布宽度/淋巴细胞比值(red blood cell distribution width-to-lymphocyte ratio, RLR)、淋巴细胞/单核细胞比值(lymphocyte-to- monocyte ratio, LMR)等在包括HCC在内的恶性肿瘤和肝衰竭预后中的作用。本研究旨在探讨术前全身炎症标志物NLR、RLR及LMR在早期小肝癌RFA后预后中的价值。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取2011年9月—2020年12月在天津市第二人民医院行RFA的132例初诊HCC患者。HCC的诊断及分期符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[2],基于动态增强MRI/CT、超声造影等2种或以上影像学支持,具体表现为动脉期病灶明显强化,门静脉期和/或平衡期病灶强化低于肝实质即“快进快出”的肝癌典型特征,伴或不伴AFP水平升高。纳入标准:(1)单个病灶直径≤3 cm;(2)巴塞罗那临床(BCLC)分期为0/A期;(3)不适合手术切除或者患者拒绝手术切除治疗;(4)接受RFA作为首次治疗。排除标准:(1)Child-Pugh分级为C级;(2)合并其他恶性肿瘤或严重心脑血管病等;(3)2周内服用过抗炎药物;(4)随访资料不全或围术期死亡;(5)随访时间<3个月。
1.2 研究方法
收集RFA前1周内的数据。一般资料:性别、年龄、BMI;病因学资料:HBV、HCV、代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)和乙醇摄入等;实验室指标:血常规、肝功能、肾功能、AFP等;影像学资料:CT、磁共振成像(MRI)、腹部彩超、超声造影等。
1.3 RFA方案
在超声引导下经皮射频消融。严格按照《2011 CSLC/CSCO/CMA肝癌射频消融治疗规范的专家共识》流程进行。患者在穿刺部位接受2%盐酸利多卡因治疗,并静脉滴注50 mg盐酸哌替啶与50 mL 5%葡萄糖水混合。手术过程中持续监测心血管和呼吸系统。对于所有肿瘤,消融边缘至少应达到肿瘤边缘以外5 mm。完全消融定义为肝脏动态增强MRI/CT或超声造影提示肿瘤所在区域为低密度(超声表现为高回声),动脉期无强化。术后28 d复查动态增强MRI/CT及动脉造影评估肿瘤是否完全消融。对于未完全消融者再次消融,直至肿瘤完全反应。
1.4 患者随访
本研究的目标事件为无复发生存(recurrence free survival, RFS)和总生存(overall survival,OS)。RFS时间定义为从RFA术后到首次复发或死亡之间的时间。OS定义为从RFA术后到患者死亡或随访截止日期之间的时间。完全消融后,患者前2年内,每3个月复查1次AFP及动态增强MRI/CT、超声造影等,之后每半年监测1次上述指标,如动态增强MRI/CT和/或超声造影提示原病灶周围或者肝内远处出现动脉期异常强化影,门脉期及平衡期密度降低,伴或不伴AFP升高,考虑肿瘤复发,记录复发肿瘤的位置、数目、大小、有无血管侵犯等。通过多学科会诊综合评估患者情况,给予针对肝癌复发的相关治疗。治疗后继续随访,直至患者死亡或研究截止日期2021年6月30日。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0软件及R语言4.0.3进行统计分析。计数资料组间比较采用χ2检验。运用X-tile工具以5年生存率及RFS率为结局事件,采用“枚举法”确定NLR、RLR和LMR的最佳截断值[12]。使用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,并采用log-rank检验比较复发及生存的组间差异。单因素分析采用log-rank检验,将log-rank检验分析中具有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归分析以确定RFS率与OS率的危险因素,计算风险比(HR)及其95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
132例患者中男性96例,平均年龄(58.50±9.66)岁。利用患者数据对5年OS和RFS进行X-tile分析,确定NLR、RLR和LMR的最佳截断值分别为4.1、18.3和6(图 1~3)。根据NLR、RLR、LMR分组与OS及RFS的相关性,将NLR、RLR及LMR按积分计算(表 1),根据N-R-L评分的得分情况将患者分为3组:N-R-L 0分组,N-R-L 1分组和N-R-L 2分组,并将其作为OS和RFS的预后指标。3组患者Child-Pugh分级、Alb比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表 2)。
表 1 N-R-L评分的计分及分组方式Table 1. Scoring and grouping of N-R-L score变量 得分 NLR <4.1 0 ≥4.1 1 RLR <18.3 0 ≥18.3 1 LMR <6 0 ≥6 1 N-R-L NLR+RLR+LMR=0 0 NLR+RLR+LMR=1 1 NLR+RLR+LMR=2 2 注:N-R-L,NLR、RLR和LMR三项评分之和。 表 2 术前N-R-L分组患者的临床特征Table 2. Clinical characteristics of patients in preoperative N-R-L group临床特征 N-R-L 0分组(n=92) N-R-L 1分组(n=29) N-R-L 2分组(n=11) χ2值 P值 性别[例(%)] 0.545 0.762 男 66(71.7) 21(72.4) 9(81.8) 女 26(28.3) 8(27.6) 2(18.2) 年龄[例(%)] 0.371 0.831 <60岁 48(52.2) 17(58.6) 6(54.5) ≥ 60岁 44(47.8) 12(41.4) 5(45.5) BMI[例(%)] 2.024 0.363 <24 kg/m2 42(45.7) 9(31.0) 5(45.5) ≥24 kg/m2 50(54.3) 20(69.0) 6(54.5) Child-Pugh分级[例(%)] 10.992 0.001 A级 81(88.0) 26(89.7) 4(36.4) B级 11(12.0) 3(10.3) 7(63.6) BCLC分期[例(%)] 3.640 0.056 0期 18(19.6) 3(10.3) 0 A期 74(80.4) 26(89.7) 11(100) 肿瘤直径[例(%)] 3.876 0.144 <2 cm 53(57.6) 17(58.6) 3(27.3) ≥2 cm 39(42.4) 12(41.4) 8(72.7) HBV感染[例(%)] 1.601 0.449 否 22(23.9) 5(17.2) 4(36.4) 是 70(76.1) 24(82.8) 7(63.6) HCV感染[例(%)] 1.029 0.598 否 76(82.6) 22(75.9) 8(71.7) 是 16(17.4) 7(24.1) 3(27.3) MAFLD[例(%)] 0.367 0.832 否 56(60.9) 16(55.2) 7(63.6) 是 36(39.1) 13(44.8) 4(36.4) AFP[例(%)] 1.266 0.531 <15 ng/mL 59(64.1) 21(72.4) 6(54.5) ≥15 ng/mL 33(35.9) 8(27.6) 5(45.5) ALBI分级[例(%)] 2.845 0.092 1级 54(58.7) 16(55.2) 5(45.4) 2级 36(39.1) 13(44.8) 3(27.3) 3级 2(2.2) 0 3(27.3) TBil[例(%)] 0.904 0.636 ≤20 μmol/L 55(59.8) 16(55.2) 5(45.5) >20 μmol/L 37(40.2) 13(44.8) 6(54.5) Alb[例(%)] 5.699 0.017 ≥35 g/L 82(89.1) 23(79.3) 7(63.6) <35 g/L 10(10.9) 6(20.7) 4(36.4) ALT[例(%)] 0.109 0.741 ≤50 U/L 76(82.6) 28(96.6) 7(63.6) >50 U/L 16(17.4) 1(3.4) 4(36.4) AST[例(%)] 1.572 0.456 ≤40 U/L 71(77.2) 24(82.8) 7(63.6) >40 U/L 21(22.8) 5(17.2) 4(36.4) MELD评分[例(%)] 3.022 0.221 <9分 65(70.7) 18(62.1) 5(45.5) ≥9分 27(29.3) 11(37.9) 6(54.5) 注:ALBI分级,白蛋白-胆红素分级。 2.2 RFA术后的复发和生存
中位随访时间为34个月(5~111个月)。所有患者的1、3和5年RFS率分别为64.3%、40.0%和21.5%,中位RFS为26个月;1、3和5年OS率分别为97.6%、82.1%和69.8%。N-R-L 0分组、N-R-L 1分组和N-R-L 2分组的1、3和5年RFS率分别为76.9%、52.5%、33.3%,42.9%、13.1%、0和11.1%、0、0(χ2=35.345,P<0.000 1)(图 4);3组的1、3和5年OS率分别为100%、96.3%、90.7%,96.6%、60.4%、41.3%和81.8%、46.8%、15.6%(χ2=38.460,P<0.000 1)(图 4)。N-R-L 0分组、N-R-L 1分组和N-R-L 2分组的中位RFS分别为38个月、10个月和5个月,组间差异有统计学意义(χ2=35.345,P<0.000 1)。
2.3 RFS率的预测因素
对患者RFA术前相关指标进行单因素及多因素分析,以确定RFS率的预测因素(表 3)。log-rank检验结果显示,男性、Child-Pugh B级、肿瘤直径≥2 cm、TBil>20 μmol/L、Alb>35 g/L、ALBI分级2/3级以及N-R-L评分1/2分与RFS率显著相关(P值均<0.05)。进一步行多因素Cox回归分析结果表明,肿瘤直径≥2 cm(HR=2.10, 95%CI: 1.28~3.43,P=0.003)、N-R-L评分1分(HR= 3.14, 95%CI: 1.81~5.46,P<0.000 1)以及N-R-L评分2分(HR=2.61, 95%CI: 1.06~6.42,P=0.037)是RFS率的独立预测因素(P值均<0.05)。
表 3 Cox回归分析RFS率的影响因素Table 3. Results of RFS by Cox regression analysis变量 单因素分析 多因素分析 HR(95%CI) P值 HR(95%CI) P值 性别(男/女) 1.97(1.14~3.40) 0.015 1.55(0.87~2.76) 0.136 BMI(≥24 kg/m2/<24 kg/m2) 1.22(0.77~1.92) 0.402 MAFLD(是/否) 1.03(0.65~1.61) 0.916 Child-Pugh分级(B级/A级) 2.58(1.50~4.45) 0.001 1.28(0.56~2.91) 0.564 肿瘤直径(≥2 cm/<2 cm) 2.28(1.43~3.62) 0.001 2.10(1.28~3.43) 0.003 BCLC分期(A期/0期) 2.06(0.89~4.75) 0.090 ALT(>50 U/L/≤50 U/L) 1.41(0.78~2.57) 0.260 AST(>40 U/L/≤40 U/L) 1.63(0.98~2.70) 0.058 TBil(≤20 μmol/L/>20 μmol/L) 1.69(1.07~2.65) 0.024 1.60(0.96~2.67) 0.074 Alb(<35 g/L/≥35 g/L) 2.45(1.45~4.12) 0.001 1.01(0.44~2.32) 0.974 AFP(>400 ng/mL/≤400 ng/mL) 0.81(0.33~2.01) 0.650 ALBI分级(ref: 1级) 2级 1.25(0.79~2.00) 0.341 0.92(0.49~1.70) 0.781 3级 4.15(1.61~10.70) 0.003 1.91(0.48~7.59) 0.356 MELD评分(>9分/≤9分) 1.44(0.91~2.28) 0.124 N-R-L得分(ref: 0分) 1分 3.13(1.89~5.20) <0.000 1 3.14(1.81~5.46) <0.000 1 2分 4.99(2.40~10.37) <0.000 1 2.61(1.06~6.42) 0.037 2.4 OS率的预测因素
表 4总结了RFA术后OS率的预测因素。log-rank检验结果提示Child-Pugh B级、肿瘤直径≥2 cm、TBil>20 μmol/L、Alb>35 g/L、ALBI分级2/3级以及N-R-L评分1/2分与OS显著相关。多因素Cox回归结果表明,肿瘤直径≥2 cm(HR=3.67, 95%CI: 1.58 ~ 8.52,P=0.002)、N-R-L评分1分(HR=8.27, 95%CI: 3.15 ~ 21.71,P<0.000 1)以及N-R-L评分2分(HR=14.59, 95%CI: 3.96 ~ 53.78,P<0.000 1)是OS率的独立预测因素。
表 4 Cox回归分析OS率的影响因素Table 4. Results of OS by Cox regression analysis变量 单因素分析 多因素分析 HR(95%CI) P值 HR(95%CI) P值 性别(男/女) 2.17(0.88~5.33) 0.093 BMI(≥24 kg/m2/<24 kg/m2) 1.64(0.78~3.44) 0.191 MAFLD(是/否) 1.20(0.58~2.51) 0.620 Child-Pugh分级(B级/A级) 3.54(1.52~8.25) 0.003 0.99(0.28~3.52) 0.987 肿瘤直径(≥2 cm/<2 cm) 2.89(1.36~6.14) 0.006 3.67(1.58~8.52) 0.002 BCLC分期(A期/0期) 1.10(0.33~3.63) 0.880 ALT(>50 U/L/≤50 U/L) 1.21(0.46~3.17) 0.705 AST(>40 U/L/≤40 U/L) 1.30(0.58~2.94) 0.530 TBil(≤20 μmol/L/>20 μmol/L) 2.27(1.08~4.76) 0.030 1.97(0.82~4.77) 0.132 Alb(<35 g/L/≥35 g/L) 3.49(1.58~7.74) 0.002 1.36(0.36~5.09) 0.649 AFP(>400 ng/mL/≤400 ng/mL) 1.35(0.41~4.50) 0.621 ALBI分级(ref: 1级) 2级 1.67(0.78~3.56) 0.184 0.97(0.35~2.65) 0.950 3级 12.94(2.55~65.68) 0.002 2.11(0.25~17.94) 0.495 MELD评分(>9分/≤9分) 1.59(0.75~3.33) 0.224 N-R-L得分(ref: 0分) 1分 6.92(2.82~17.00) <0.000 1 8.27(3.15~21.71) <0.000 1 2分 13.50(4.68~38.91) <0.000 1 14.59(3.96~53.78) <0.000 1 3. 讨论
多项研究表明,对于不可切除的早期小肝癌,RFA能提供良好的治疗效果。本研究选取了单发直径≤3 cm的早期/极早期HCC患者,将RFA作为首次治疗方法。在整个随访期内,共有77例(58.3%)复发,29例(22%)死亡,与先前研究[4, 13-14]结果类似。所有患者接受RFA治疗后,仅3例患者出现轻微并发症,经治疗后均好转,没有患者出现严重并发症,表明RFA安全性较高,更具成本效益。
评估了RFA率与OS率的危险因素,发现肿瘤直径≥2 cm、N-R-L评分1分及2分与患者不良预后独立相关。HCC的复发及预后的差异与初始肿瘤大小相关已经在先前的研究[15-16]中被证实。在HCC的发生发展中,随着病灶直径的增加,微浸润的发生率明显增加,这可能是HCC治疗后复发的重要原因。研究[4]表明,对于直径≤3 cm的HCC患者,HCC≥2 cm的微转移和微血管浸润更明显。另外,肿瘤直径增大可能造成消融不彻底,残存的微病灶直接导致复发,这些结果均会影响患者的生存预后。
炎症在肿瘤发生发展的各个阶段均发挥重要作用,可驱动肿瘤的发生、生长、进展和转移等重要过程[17-18]。除了局部肿瘤微环境外,全身性炎症反应通过干扰组织内环境稳态从而影响肿瘤的发展,特别是肿瘤的转移[19]。血常规作为反映全身炎症反应最普遍的工具,在临床广泛应用且易于获取。单独的血细胞计数可能与整体预后没有显著关系,但由这些细胞计数组合产生的全身炎症标志物如NLR、RLR和LMR等被认为是各类癌症的独立预测因素。
淋巴细胞是机体免疫监视和免疫应答的重要组成成分,参与肿瘤的免疫反应,特别是在抗肿瘤增殖和转移的过程[20]。淋巴细胞浸润增加与癌症患者预后良好相关[21],而淋巴细胞数量减少和功能抑制可能会削弱肿瘤特异性免疫,造成利于肿瘤侵袭和转移的环境,进而影响患者预后[22-23]。中性粒细胞可直接释放炎症因子,促进肿瘤血管生成,加速肿瘤的生长和转移[24]。NLR是反映中性粒细胞促肿瘤特性与淋巴细胞抗肿瘤宿主免疫反应之间平衡的一个因素,但在炎症环境下,随着中性粒细胞增加和淋巴细胞减少,这一平衡被打破,直接导致机体抗肿瘤能力下降。这提示机体处于抗肿瘤免疫抑制状态,炎症反应将向促肿瘤进展方向发展,最终导致患者预后不良。另外,炎症可以刺激单核细胞到外周血,进而被招募到肿瘤组织并分化为肿瘤相关巨噬细胞,进一步与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤进展[25-26]。红细胞分布宽度(red blood cell distribution width, RDW)反映了红细胞在循环中体积分布的变化。有研究[27]表明RDW升高与HCC患者无病生存率较低和OS率较差相关。而作为RDW与淋巴细胞比值, RLR升高已被证明能够预测肝功能衰竭和结肠癌的不良预后,并与肝硬化的严重程度相关[9-10, 28]。
与先前结果一致,本研究亦明确了NLR、RLR和LMR在早期小肝癌RFA后的预后价值。由于先前研究对于上述炎症标志物的分组尚无统一标准,本研究采用X-tile工具基于患者5年OS及RFS计算出3个指标的最佳截断值分别为4.1、18.3和6,据此分组后三者在患者RFS及OS方面均表现出优异的预后价值,特别是将三者结合后得到的N-R-L评分,在N-R-L评分≥1与早期HCC首次RFA后的早期复发和预后不良显著相关,因此可作为早期HCC患者RFA治疗预后不良的独立预后生物标志物。
另外,本研究的大多数患者为HBV或HCV相关HCC,机体本身存在慢性持续性炎症。肿瘤相关炎症反应刺激炎症介质的释放,加之血细胞计数异常所致的抗肿瘤免疫功能下降,为肿瘤的侵袭和转移提供有利条件。提示炎症反应越明显,N-R-L评分越高,患者预后也越差。
总之,全身炎症反应标志物N-R-L评分作为一种简单、易于获取且成本极低的指标,有望成为有用的无创生物标志物,用以预测早期HCC患者RFA术后的复发和生存。
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表 1 RT-PCR引物列表
Table 1. List of RT-PCR primers
基因名称 引物序列(5′-3′) Tm值(℃) MTIF2 F-MTIF2 CTATGATGCTTCACACGAGTG 53 R-MTIF2 TGCTCTTCCACAGCACAGG 53 RPL10 F-RPL10 CGGTATTGTAAGAACAAGCCGT 60 R-RPL10 GCCACAAAGCGGAAACTCAT 60 pgRNA F-pgRNA CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT 53 R-pgRNA TGGATAAAACCTAGCAGGCATAAT 53 GAPDH F-GAPDH CAGGAGGCATTGCTGATGAT 52 R-GAPDH GAAGGCTGGGGCTCATTT 52 表 2 黄芪甲苷对人正常肝细胞L-02细胞生长活性的影响
Table 2. Effect of Astragaloside Ⅳ on L-02 cell growth activity
组别 细胞活性(%) 24 h 48 h 72 h 0 μg/mL组 95.11±0.88 91.69±0.52 90.85±1.41 5 μg/mL组 94.40±6.05 92.35±3.81 91.13±3.371) 10 μg/mL组 94.31±7.44 94.47±4.60 91.64±1.84 20 μg/mL组 100.23±1.401) 97.35±0.671) 99.56±0.442) F值 0.682 1.433 8.301 P值 0.617 0.362 0.030 注:与0 μg/mL组比较,1)P<0.05;与10 μg/mL组,2)P<0.05。 表 3 黄芪甲苷对L-02细胞凋亡的影响
Table 3. Effect of Astragaloside Ⅳ on L-02 cell apoptosis
组别 死亡率(%) 凋亡率(%) 死亡+凋亡率(%) 0 μg/mL组 2.74±0.45 2.72±0.27 5.46±0.72 5 μg/mL组 3.07±0.68 3.27±0.43 6.34±0.92 10 μg/mL组 3.16±0.56 3.10±0.34 6.26±0.47 20 μg/mL组 3.35±0.69 2.96±0.76 6.31±0.96 F值 0.533 0.689 0.853 P值 0.672 0.584 0.503 表 4 不同浓度的黄芪甲苷处理对L-02外泌蛋白的影响
Table 4. Effect of different concentrations of Astragaloside Ⅳ treatment on L-02 cell exoprotein
组别 AFP(ng/mL) ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L) 0 μg/mL组 13.25±0.20 6.46±0.67 5.68±0.21 40.68±0.61 5 μg/mL组 14.75±0.201) 6.27±0.16 7.63±0.221) 38.68±0.921) 10 μg/mL组 14.48±0.131) 3.09±0.081)2) 6.57±0.461) 40.37±0.37 20 μg/mL组 14.42±0.481) 1.80±0.131)2)3) 7.61±0.171) 43.77±0.341) F值 16.180 129.523 31.670 36.847 P值 0.001 0.001 0.001 0.001 注:与0 μg/mL组比较,1)P<0.05;与5 μg/mL组,2)P<0.05;与10 μg/mL组,3)P<0.05。 表 5 黄芪甲苷对HBV复制装配中相关基因及蛋白表达的影响
Table 5. The effect of Astragaloside Ⅳ on the expression of related genes and proteins in HBV replication assembly
组别 HBV DNA(IU/mL) pgRNA HBsAg HBeAg RPL10 MTIF2 0 μg/mL组 43 300.00±23 356.25 1.07±0.09 0.70±0.03 0.62±0.06 1.30±0.51 1.02±0.05 5 μg/mL组 7 420.00±955.981) 0.46±0.191) 0.58±0.041) 0.41±0.041) 0.79±0.041) 0.51±0.181) 10 μg/mL组 6 730.00±141.071) 0.63±0.131) 0.32±0.041) 0.46±0.011) 0.32±0.041) 0.63±0.081) 20 μg/mL组 4900.00±400.371) 0.74±0.031) 0.56±0.051) 0.34±0.021) 0.56±0.051) 0.56±0.221) F值 7.532 12.159 33.026 17.251 4.633 4.712 P值 0.010 0.002 0.003 0.009 0.037 0.035 注:与0 μg/mL组比较,1)P<0.05。 -
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