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旋覆花汤对高脂高果糖高胆固醇饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的影响
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2023.06.014
Effect of Xuanfuhua decoction on a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis induced by high-fat, high-fructose, and high-cholesterol diet
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摘要:
目的 探讨旋覆花汤对高脂高果糖高胆固醇饮食诱导小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的干预作用。 方法 32只雄性C57/BL6J小鼠随机分为正常组、模型组、旋覆花汤组和奥贝胆酸组，每组8只。高脂高果糖高胆固醇饮食造模第24周开始，各组给予相应药物干预，旋覆花汤组给药剂量为14.19 g/kg灌胃，奥贝胆酸组给药剂量为10 mg/kg灌胃，灌胃体积均为20 mL/kg，每天给药1次，连续6周。HE染色、油红O染色、天狼星红染色及Masson染色观察肝组织病理学变化、脂质沉积及胶原沉积；试剂盒检测血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C和葡萄糖水平，肝组织TG及羟脯氨酸(Hyp)含量；实时荧光定量聚合酶链式反应检测肝组织脂质代谢相关、炎症相关以及纤维化相关基因的表达；免疫组化染色观察肝组织F4/80和α-SMA阳性表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与正常组相比，模型组小鼠体质量、肝湿重、血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C和葡萄糖水平均显著增高(P值均＜0.01)；HE染色显示，模型组小鼠肝组织可见肝细胞脂肪变，大量脂肪空泡，肝细胞气球样变以及炎症细胞浸润，且非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAS)较正常组显著增加(P＜0.01)；油红O染色显示，模型组小鼠肝细胞内有大量红色脂滴沉积，大小不一，油红O染色面积百分比和肝脏TG含量较正常组均显著增加(P值均＜0.01)；天狼星红染色和Masson染色显示，模型组小鼠窦周、中央静脉以及汇管区胶原纤维增生明显，且肝组织Hyp含量较正常组显著增加(P＜0.05)。与模型组比较，旋覆花汤组小鼠血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C及葡萄糖水平均明显降低(P值均＜0.05)；肝组织脂肪变、炎症浸润、脂滴沉积以及胶原纤维增生明显改善，且NAS、油红O染色面积百分比、肝脏TG含量及Hyp含量均显著降低(P值均＜0.05)。与正常组相比，模型组小鼠肝组织脂质代谢相关基因SREBP-1c、FASN、SCD1、PPARγ和CD36，炎症相关基因F4/80、TNFα、CCL2和CD11b，以及纤维化相关基因α-SMA mRNA表达水平均显著增高(P值均＜0.05)；免疫组化染色结果显示，F4/80和α-SMA阳性表达显著增加(P值均＜0.01)。与模型组比较，旋覆花汤组小鼠肝组织SREBP-1c、FASN、SCD1、PPARγ、CD36、F4/80、TNFα、CCL2、CD11b及α-SMA mRNA表达均显著降低(P值均＜0.05)，免疫组化染色F4/80和α-SMA阳性表达明显减少(P值均＜0.01)。 结论 旋覆花汤对高脂高果糖高胆固醇诱导的小鼠NASH具有良好的干预作用，其可显著抑制肝脏脂质沉积、炎症反应及肝纤维化。 -
关键词:
- 非酒精性脂肪性肝炎 /
- 旋覆花汤 /
- 小鼠, 近交C57BL
Abstract:Objective To investigate the intervention effect of Xuanfuhua decoction on mice with nonalcoholic steatohepatitis (NASH) induced by high-fat, high-fructose, and high-cholesterol diet. Methods A total of 32 male C57/BL6J mice were randomly divided into normal group, model group, Xuanfuhua decoction group, and obeticholic acid group, with 8 mice in each group. Since week 24 of modeling using high-fat, high-fructose, and high-cholesterol diet, each group was given the corresponding drug for intervention at a dose of 14.19 g/kg by gavage for the Xuanfuhua decoction group and 10 mg/kg by gavage for the obeticholic acid group and a volume of 20 mL/kg for gavage, once a day for 6 consecutive weeks. HE staining, oil red O staining, Sirius Red staining, and Masson staining were used to observe the pathological changes, lipid deposition, and collagen deposition of liver tissue; related kits were used to measure the serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and glucose, as well as the content of TG and hydroxyproline (Hyp) in liver tissue; quantitative real-time PCR was used to measure the expression of genes associated with lipid metabolism, inflammation, and fibrosis in liver tissue; immunohistochemical staining was used to observe the positive expression of F4/80 and α-SMA in liver tissue. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the normal group, the model group had significant increases in body weight, liver wet weight, and serum levels of AST, ALT, TC, TG, LDL-C and glucose (all P < 0.01). HE staining showed hepatocyte steatosis, a large number of fat vacuoles, hepatocyte ballooning degeneration, and inflammatory cell infiltration in liver tissue of the mice in the model group, and the model group had a significant increase in NAFLD activity score (NAS) compared with the normal group (P < 0.01). Oil red O staining showed the deposition of a large number of red lipid droplets with different sizes in hepatocytes of the mice in the model group, and compared with the normal group, the model group had significant increases in the area percentage of oil red O staining and the content of TG in the liver (P < 0.01). Sirius Red staining and Masson staining showed significant collagen fiber hyperplasia in the perisinusoidal area, the central vein, and the portal area in the model group, and the model group had a significant increase in the content of Hyp in liver tissue compared with the normal group (P < 0.05). Compared with the model group, the Xuanfuhua decoction group had significant reductions in the serum levels of AST, ALT, TC, TG, LDL-C, and glucose (all P < 0.05), significant improvements in hepatic steatosis, inflammatory infiltration, lipid droplet deposition, and collagen fiber hyperplasia, and significant reductions in NAS score, area percentage of oil red O staining, and content of TG and Hyp in the liver (all P < 0.05). Compared with the normal group, the model group had significant increases in the mRNA expression levels of lipid metabolism-related genes (SREBP-1c, FASN, SCD-1, PPAR-γ, and CD36), inflammation-related genes (F4/80, TNF-α, CCL2, and CD11b), and the fibrosis-related gene α-SMA (all P < 0.05), and immunohistochemical staining showed significant increases in the positive expression of F4/80 and α-SMA (P < 0.01). Compared with the model group, the Xuanfuhua decoction group had significant reductions in the mRNA expression levels of SREBP-1c, FASN, SCD-1, PPAR-γ, CD36, F4/80, TNF-α, CCL2, CD11b, and α-SMA in liver tissue (all P < 0.05), and immunohistochemical staining showed significant reductions in the positive expression of F4/80 and α-SMA (P < 0.01). Conclusion Xuanfuhua decoction has a good intervention effect on mice with NASH induced by high fat, high fructose, and high-cholesterol diet and can significantly inhibit hepatic lipid deposition, inflammatory response, and liver fibrosis. -
Key words:
- Non-alcoholic Steatohepatitis /
- Xuanfuhua Decoction /
- Mice, Inbred C57BL
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种临床常见的遗传-环境-代谢-应激相关性肝病，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌[1]。随着肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢紊乱人群的增多，NAFLD现已成为全球最常见的慢性肝病之一[2-3]。NASH作为NAFLD的重要进展性病程，若不加以治疗，可进一步发展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌[4-5]。尽管NASH的研究不断获得重要进展，但治疗措施仍十分有限。目前认为单纯性脂肪肝的治疗仅需改变生活方式即可，而NASH则需要在此基础上进行药物干预[6]。遗憾的是，即使临床现有大量的在研药物，但通常因试验结果没有达到主要终点或存在风险大于收益的副作用而相继宣告失败，使得至今尚无获批的临床药物治疗NASH。因此，积极研发NASH的临床药物具有重要意义。根据临床表现和体征，NASH可归属于中医学的“胁痛”“肝积”“肝癖”等范畴。中医学认为本病多因过食肥甘、情志失调、劳逸失常等导致肝、脾、肾功能失调，影响气血津液运化与输布，进而引起痰湿、血瘀蕴结于肝而发此病，临床上常采用疏肝健脾、祛湿化痰、活血化瘀等治法治疗[7-8]。本病病位在肝，肝为藏血之脏，初病在气，久病及血；因此，“气郁血瘀”病机在本病的论治当中也尤显重要。旋覆花汤由旋覆花、新绛(茜草)、葱茎组成，主治肝着，具有活血化瘀、疏肝通络之功。目前旋覆花汤在NASH中的研究尚未见报道，本研究旨在观察旋覆花汤对高脂高果糖高胆固醇饮食诱导小鼠NASH的影响，以明确旋覆花汤对实验性NASH的干预作用，为旋覆花汤治疗NASH提供部分科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
32只SPF级C57BL/6J雄性小鼠，6~8周龄，体质量18~20 g，购自上海斯莱克实验动物公司[生产许可证编号：SCXK(沪)2021-0004；使用许可证编号：SYXK(沪)2021-0005]。所有小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。
1.2 药物与试剂
旋覆花(安徽省万生中药饮片有限公司，批号：210201)，茜草(衢州南孔中药饮片有限公司，批号：2104087)；高脂高果糖高胆固醇饲料(美国Research Diets公司，货号：D09100310)；HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒、油红O染色试剂盒及羟脯氨酸(Hyp)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号或货号分别为20210720、D026-1-3、D027-1、A030-2)；甘油三酯(TG)检测试剂盒(浙江东瓯诊断产品有限公司，货号：R0327)；奥贝胆酸(大连美仑生物技术有限公司，货号：MB6084)；Trizol试剂(上海生工生物工程股份有限公司，批号：G826KA6730)；RNA逆转录试剂盒(加拿大Applied Biological Materials公司，货号：G486)；SYBRⓇ Green Pro Taq HS预混型实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)试剂盒(含ROX)(湖南艾科瑞生物工程有限公司，批号：AG11718)。PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表 1。
表 1 PCR引物序列Table 1. PCR Primer sequence基因 引物序列 GAPDH 上游 5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3′ 下游 5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′ CD36 上游 5′-GGACATTGAGATTCTTTTCCTCTG-3′ 下游 5′-GCAAAGGCATTGGCTGGAAGAAC-3′ SREBP-1c 上游 5′-CGACTACATCCGCTTCTTGCAG-3′ 下游 5′-CCTCCATAGACACATCTGTGCC-3′ FASN 上游 5′-CACAGTGCTCAAAGGACATGCC-3′ 下游 5′-CACCAGGTGTAGTGCCTTCCTC-3′ SCD1 上游 5′-GCAAGCTCTACACCTGCCTCTT-3′ 下游 5′-CGTGCCTTGTAAGTTCTGTGGC-3′ PPARγ 上游 5′-GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGCC-3′ 下游 5′-ATCTCCGCCAACAGCTTCTCCT-3′ F4/80 上游 5′-CGTGTTGTTGGTGGCACTGTGA-3′ 下游 5′-CCACATCAGTGTTCCAGGAGAC-3′ CD11b 上游 5′-TACTTCGGGCAGTCTCTGAGTG-3′ 下游 5′-ATGGTTGCCTCCAGTCTCAGCA-3′ TNFα 上游 5′-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3′ 下游 5′-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3′ CCL2 上游 5′-GCTACAAGAGGATCACCAGCAG-3′ 下游 5′-GTCTGGACCCATTCCTTCTTGG-3′ α-SMA 上游 5′-TGCTGACAGAGGCACCACTGAA-3′ 下游 5′-CAGTTGTACGTCCAGAGGCATAG-3′ 注：GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；CD36，脂肪酸转运蛋白；SREBP-1c，固醇调节元件结合蛋白-1c；FASN，脂肪酸合酶；SCD1，正硬脂酰辅酶A去饱和酶1；PPARγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ；F4/80，小鼠含生长因子样模体黏液样激素样受体；CD11b，分化抗原簇分子11b；TNFα，肿瘤坏死因子α；CCL2，趋化因子配体2；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白。 1.3 仪器
XFSTPRP-48型全自动研磨仪(上海净信科技有限公司)；5415R型高速低温离心机(美国Olympus公司)；F200 PRO型酶标仪(瑞士Tecan集团公司)；VIIA 7型PCR仪(美国ABI公司)；ASP300型自动脱水机(德国Leica公司)；EG1160型组织包埋机(德国Leica公司)；RM2035型轮转切片机(德国Leica公司)；SCN400型数据扫描切片机(德国Leica公司)。
1.4 方法
1.4.1 药物制备
旋覆花汤制备：《金匮要略》关于本方剂量的记载为旋覆花三两、葱十四茎、新绛少许。旋覆花根据汉代度量衡制进行古今剂量换算，葱茎根据药材实测，新绛根据参考文献[9-10]，可得每剂旋覆花约46.875 g、葱茎20 g(小葱十四茎)、茜草10 g(取代新绛少许)。取旋覆花187.5 g，葱白80 g，茜草40 g，放入砂锅中，加入旋覆花汤10倍量(2.46 L)的双蒸水，浸泡30 min，加热，煮沸30 min，倒出药液，再加入6倍量(1.845 L)的双蒸水，加热，煮沸30 min，倒出药液，合并两次滤液，砂锅加热浓缩至433.1 L，即得生药量0.71 g/mL提取物溶液。
1.4.2 动物模型制备与分组给药
32只C57BL/6J雄性小鼠动物房适应性饲养1周后，随机分为正常组(n=8)和NASH造模组(n=24)。正常组小鼠给予正常饲料喂养，NASH造模组小鼠给予高脂高果糖高胆固醇饲料(成分：40%脂肪热量、20%果糖热量、2%胆固醇)喂养。造模第24周末，24只NASH造模组小鼠根据体质量进行区组随机分组，分别为：模型组、旋覆花汤组、奥贝胆酸组，每组8只。实验药物均使用0.3%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制，正常组和模型组小鼠给予0.3% CMC-Na，旋覆花汤组给药剂量为14.19 g/kg(相当于生药量0.71 g/mL)，奥贝胆酸组给药剂量为10 mg/kg，灌胃体积均为20 mL/kg，每天1次，连续6周，第30周末给药结束后禁食不禁水12 h。实验结束后经麻醉收集小鼠血清和肝组织样本，以用于后续相关实验。
1.4.3 全自动化分析法分析血清生化相关指标
取150 μL血清样本送至上海中医药大学附属曙光医院检验科，分别检测血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平。
1.4.4 酶法检测肝组织TG含量
称取50 mg肝组织，加入已预冷的750 μL丙酮和无水乙醇混合液(1∶ 1)匀浆2次。匀浆液置于4 ℃冰箱静置过夜。次日，将匀浆液3 000 r/min离心15 min。根据试剂盒说明书，取匀浆上清液9 μL，再加入TG检测液900 μL，充分振荡、混匀，最后取200 μL待测液加入96孔板中，37 ℃孵育5 min。使用多功能酶标仪于546 nm波长处读取各孔光密度(OD)值，并按照说明书的方法计算肝组织的TG含量。
1.4.5 HE染色、天狼星红染色及Masson染色观察肝脏组织学变化
对肝组织进行固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，随后再分别进行HE染色、天狼星红染色及Masson染色，将染色好的切片进行中性树脂胶封片，待切片晾干之后使用数据扫描切片机对切片进行自动扫描。
1.4.6 油红O染色观察肝脏脂质沉积
将制备好的肝组织冰冻切片包埋剂样本进行8 μm切片，随后将切片置于室温下复温10 min，油红O染色贮备液对脂滴染色15 min，自来水清洗3 min；油红O染色复染液对细胞核染色3 min，自来水清洗1 min，水性封固剂封片。光镜下观察肝组织红色脂滴沉积情况，并使用Image-Pro Plus软件对油红O染色红色脂滴面积进行半定量分析。
1.4.7 qPCR检测小鼠肝组织相关基因表达
首先对肝组织RNA进行抽提，称取50 mg肝组织，分别加入1 mL Trizol进行匀浆、裂解，200 μL三氯甲烷使蛋白和RNA迅速脱离，600 μL异丙醇沉淀RNA，1 mL 75%乙醇及无水乙醇洗脱，吸弃残余乙醇，晾干，加入50 μL DEPC水充分溶解，即得到总RNA。随后对总RNA进行cDNA逆转录。最后将cDNA与SYBR green premix试剂混合后置于VIIA 7型PCR仪中进行qPCR扩增，目标基因的相对表达量以GAPDH标准化，采用2-ΔΔCt计算各肝组织中mRNA相对表达量。
1.4.8 碱水法检测肝组织Hyp含量
按照检测试剂盒步骤称取50 mg肝组织，加入1 mL水解液置于95 ℃水浴锅中水解20 min，依次加入10 μL指示剂，1 mL调pH甲液，200 μL调pH乙液对水解液进行pH值调整，随后对样本进行双蒸水稀释、活性炭离心纯化，再依次加入试剂一、试剂二、试剂三与样本进行反应，60 ℃水浴15 min，3 500 r/min离心10 min，取200 μL上清液加入96孔生化板中，在波长550 nm处测定各孔OD值，根据说明书计算公式对Hyp含量进行计算。
1.4.9 免疫组化染色观察肝组织F4/80和α-SMA蛋白表达
石蜡切片溶蜡，脱蜡，柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢对内源性过氧化物酶活性灭活15 min，10%山羊血清对非特异性抗原封闭30 min，滴加一抗(F4/80和α-SMA，1∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min，滴加二抗，37 ℃避光孵育30 min，DAB显色，苏木素染核，0.4%盐酸乙醇分化，自来水冲洗至细胞核变蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，晾干，使用数据扫描切片机自动扫描切片，采用ImageJ软件对F4/80、α-SMA的阳性表达进行半定量分析。
1.5 统计学方法
使用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 旋覆花汤对NASH小鼠体质量和肝湿重的影响
与正常组比较，模型组小鼠体质量、肝湿重显著升高(P值均＜0.01)；旋覆花汤组和奥贝胆酸组小鼠体质量、肝湿重与模型组比较，差异均无统计学意义(P值均＞0.05)；旋覆花汤组与奥贝胆酸组之间小鼠体质量、肝湿重差异亦无统计学意义(P值均＞0.05)(表 2)。
表 2 各组小鼠体质量和肝湿重结果比较Table 2. Comparison of body weight and liver wet weight of mice in each group组别 动物数(只) 体质量(g) 肝湿重(g) 正常组 8 33.90±1.60 1.26±0.07 模型组 8 43.78±3.321) 3.33±0.591) 旋覆花汤组 8 41.30±2.83 2.74±0.58 奥贝胆酸组 8 41.95±3.72 2.81±0.59 F值 12.825 18.230 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01。 2.2 旋覆花汤对NASH小鼠血清肝酶活性、血脂及血糖的影响
与正常组比较，模型组小鼠的血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平均显著升高(P值均＜0.01)；与模型组比较，旋覆花汤组小鼠ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平均明显降低(P值均＜0.05)；旋覆花汤组与奥贝胆酸组比较，上述指标差异均无统计学意义(P值均＞0.05)(表 3)。
表 3 各组小鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C及葡萄糖水平变化Table 3. Changes of serum ALT, AST, TC, TG and glucose levels in mice of each group组别 动物数(只) ALT (U/L) AST (U/L) 葡萄糖(mmol/L) TC (mmol/L) TG (mmol/L) LDL-C (mmol/L) 正常组 8 32.83±6.82 139.67±16.88 5.45±1.27 3.61±0.39 0.85±0.07 0.21±0.02 模型组 8 348.67±89.131) 392.83±66.621) 8.22±0.831) 9.83±1.221) 1.28±0.121) 1.28±0.051) 旋覆花汤组 8 191.50±67.293) 279.67±62.733) 6.32±1.482) 6.96±0.993) 1.03±0.183) 1.03±0.072) 奥贝胆酸组 8 239.67±67.753) 282.33±80.343) 6.53±0.882) 6.73±0.873) 1.08±0.172) 0.87±0.072) F值 24.153 17.082 6.095 45.951 9.021 78.603 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.004 ＜0.001 0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。 2.3 旋覆花汤对NASH小鼠肝组织病理学变化的影响
HE染色结果显示，正常组小鼠肝脏组织肝小叶与汇管区结构正常，肝索排列整齐。与正常组比较，模型组小鼠肝组织可见严重的肝细胞脂肪变，大量脂肪空泡，且大小不一，小叶内炎性灶，肝细胞气球样变；与模型组比较，旋覆花汤组和奥贝胆酸组小鼠肝组织肝细胞脂肪变、小叶内炎性灶以及肝细胞气球样变明显降低(图 1)。对肝组织病理学变化进行非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAFLD activity score, NAS)，结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织NAS总分显著增加(P＜0.01)；与模型组比较，旋覆花汤均＜0.05)，而旋覆花汤组和奥贝胆酸组之间差异无统计学意义(P＞0.05)(表 4)。
图 1 各组小鼠肝组织HE染色(×100)注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。Figure 1. HE staining of liver tissue in mice of each group (×100)表 4 各组小鼠肝脏病理学NASTable 4. NAS of liver pathology in mice of each group组别 动物数(只) 肝细胞脂肪变(分) 小叶内炎症(分) 肝细胞气球样变(分) 总分 正常组 8 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 模型组 8 3.00±0.001) 1.83±0.751) 2.00±0.001) 6.83±0.751) 旋覆花汤组 8 1.83±0.753) 0.83±0.413) 1.00±0.632) 3.67±1.212) 奥贝胆酸组 8 2.00±0.893) 1.00±0.632) 1.17±0.752) 4.17±1.472) F值 27.439 11.961 14.314 45.951 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。 组和奥贝胆酸组小鼠肝组织NAS总分显著降低(P值
2.4 旋覆花汤对NASH小鼠肝脏脂质沉积的影响
油红O染色显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织内出现大量、形态大小不一的红色脂滴沉积，排列紧密；而旋覆花汤组和奥贝胆酸组小鼠肝组织脂滴沉积较模型组明显减少(图 2)。对油红O染色进行半定量分析，结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织油红O染色面积百分比显著增加(P＜0.01)，而旋覆花汤组和奥贝胆酸组小鼠肝组织油红O染色面积百分比显著降低(P值均＜0.05)。肝脏TG含量测定结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝脏TG含量显著增加(P＜0.01)，而旋覆花汤或奥贝胆酸药物干预后可显著降低小鼠肝组织TG含量(P值均＜0.01)。上述指标在旋覆花汤组和奥贝胆酸组之间差异均无统计学意义(P值均＞0.05)(表 5)。
图 2 各组小鼠肝组织油红O染色(×50)注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。Figure 2. Oil red O staining of liver tissue in mice of each group (×50)表 5 各组小鼠肝组织油红O染色面积百分比和肝脏TG含量Table 5. Oil red O staining area ratio and hepatic TG content of mice in each group组别 动物数(只) 油红O染色面积百分比(%) 肝组织TG (μg/g) 正常组 8 0.70±0.31 47.94±17.33 模型组 8 41.48±4.321) 172.34±22.501) 旋覆花汤组 8 24.76±6.562) 115.98±24.813) 奥贝胆酸组 8 27.75±7.392) 127.22±24.913) F值 59.233 31.058 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。 2.5 旋覆花汤对NASH小鼠肝脏脂质代谢相关mRNA表达的影响
qPCR结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织PPARγ、CD36、SCD1、FASN及SREBP-1c mRNA表达显著上升(P值均＜0.05)。与模型组比较，旋覆花汤组PPARγ、CD36、SCD1、FASN及SREBP-1c mRNA表达均明显降低(P值均＜0.05)，奥贝胆酸组CD36、SCD1和FASN mRNA表达亦显著下降(P值均＜0.05)(表 6)。
表 6 各组小鼠脂质代谢相关基因表达Table 6. The expressions of lipid metabolism related genes in mice of each group组别 动物数(只) PPARγ mRNA相对表达量 CD36 mRNA相对表达量 SCD1 mRNA相对表达量 FASN mRNA相对表达量 SREBP-1c mRNA相对表达量 正常组 8 1.00±0.06 1.00±0.05 1.00±0.16 1.00±0.19 1.00±0.10 模型组 8 2.44±0.372) 2.70±0.252) 2.93±0.102) 2.64±1.692) 2.63±0.411) 旋覆花汤组 8 1.62±0.213) 1.96±0.084) 2.00±0.094) 1.20±0.453) 1.35±0.353) 奥贝胆酸组 8 1.78±0.31 1.87±0.134) 2.10±0.194) 1.40±0.543) 1.76±0.16 F值 29.605 21.404 31.045 3.878 6.034 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.025 0.004 注：与正常组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与模型组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01。 2.6 旋覆花汤对NASH小鼠肝脏炎症相关mRNA和蛋白表达的影响
qPCR实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠TNFα、CD11b、CCL2及F4/80 mRNA表达显著升高(P值均＜0.05)。与模型组比较，旋覆花汤组TNFα、CD11b、CCL2及F4/80 mRNA表达均显著下降(P值均＜0.05)，奥贝胆酸组TNFα、CD11b和F4/80 mRNA表达亦明显降低(P值均＜0.05)。免疫组化染色及其阳性面积百分比结果显示，正常组小鼠肝组织有少量F4/80蛋白阳性表达，主要分布在肝窦中，而模型组F4/80蛋白阳性表达较正常组显著升高(P＜0.05)，旋覆花汤或奥贝胆酸药物干预后，F4/80蛋白阳性表达较模型组均显著降低(P值均＜0.01)(图 3，表 7)。
图 3 各组小鼠肝组织F4/80免疫组化染色(×100)注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。Figure 3. F4/80 immunohistochemical staining of liver tissue in mice of each group (×100)表 7 各组小鼠肝脏炎症相关基因和蛋白表达Table 7. The expressions of hepatic inflammation related genes and protein in each group组别 动物数(只) mRNA相对表达量 F4/80蛋白阳性面积百分比(%) TNFα CD11b CCL2 F4/80 正常组 8 1.00±0.18 1.00±0.38 1.00±0.16 1.00±0.19 2.11±0.62 模型组 8 3.78±0.671) 3.33±0.231) 2.93±0.101) 2.64±1.691) 6.38±0.451) 旋覆花汤组 8 2.28±0.433) 2.22±0.743) 2.00±0.093) 1.20±0.453) 3.40±0.673) 奥贝胆酸组 8 2.49±0.613) 2.54±0.472) 2.10±0.19 1.40±0.543) 3.97±0.543) F值 30.138 23.167 14.449 12.761 28.787 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.05；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。 2.7 旋覆花汤对NASH小鼠肝脏胶原沉积和α-SMA的影响
天狼星红染色和Masson染色显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织窦周、中央静脉以及汇管区可见明显的胶原纤维增生；与模型组比较，旋覆花汤组和奥贝胆酸组小鼠肝组织胶原纤维增生均得到不同程度的改善。肝组织Hyp含量分析结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织Hyp含量显著增加(P＜0.05)，旋覆花汤组和奥贝胆酸组肝组织Hyp含量较模型组显著降低(P值均＜0.01)。α-SMA免疫组化染色及其阳性面积百分比结果显示，正常组小鼠肝组织α-SMA蛋白在窦周、中央静脉以及汇管区有较少阳性表达，而模型组肝组织α-SMA蛋白阳性表达较正常组显著增加(P＜0.05)；与模型组比较，旋覆花汤组和奥贝胆酸组肝组织α-SMA蛋白阳性表达均得到显著改善(P值均＜0.01)。此外，qPCR结果与免疫组化结果一致，即旋覆花汤组肝组织α-SMA mRNA表达较模型组显著降低(P＜0.01)(图 4，表 8)。
图 4 各组小鼠肝组织天狼星红染色、Masson染色及α-SMA免疫组化染色结果(×100)Figure 4. Sirius red staining, Masson staining and α-SMA immunohistochemical staining in mice of each group (×100)表 8 各组小鼠肝组织Hyp含量、α-SMA免疫组化染色阳性面积百分比和基因表达Table 8. Hepatic Hyp content, percentage of positive area of α-SMA immunohistochemical staining and gene expression in mice of each group组别 动物数(只) 肝组织Hyp (μg/g) α-SMA阳性面积百分比(%) α-SMA mRNA相对表达量 正常组 8 244.74±36.72 1.21±0.16 1.00±0.27 模型组 8 574.01±54.401) 4.88±0.651) 2.75±0.721) 旋覆花汤组 8 446.15±57.732) 2.23±0.102) 1.69±0.442) 奥贝胆酸组 8 464.48±79.082) 2.87±0.312) 1.92±0.262) F值 32.530 51.894 14.650 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.05；与模型组比较，2)P＜0.01。 3. 讨论
近年来，有关NAFLD对人体健康危害的研究越来越多。研究[11]表明，NAFLD可导致约10.0%的全因死亡率，及超过30.0%的肝病和糖尿病相关死亡率。NAFLD作为代谢综合征的重要组成部分还与2型糖尿病、高血压及心血管疾病的发生发展密切相关[12]。NASH是NAFLD的进展性病程，其发病机制极其复杂，目前“多重平行打击”假说被用以解释这一复杂的发病机制，该理论认为NASH的发生发展是由多种因素所致，以及多种细胞类型和多种组织器官平行相互作用的结果，包括肠道微生物群的失调、促炎症细胞因子的释放、胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、肝脏氧化应激、炎症以及遗传/表观遗传等因素[13-14]。遗憾的是，尽管NASH发病机制不断获得新的进展，但决定单纯性脂肪肝向NASH进展的关键分子机制目前仍不明确，至今也尚无任何权威机构批准用于治疗NASH的临床药物上市，使得对该病的治疗研究成为难点[15]。近年来，随着中医药的不断发展，诸多中成药如胆宁片[16]、当飞利肝宁胶囊[17]等，中药复方如苓桂术甘汤[18]、二陈汤[19]及祛湿化瘀方[20]等相继用于临床研究和治疗，均表现出了良好的干预作用，但仍有待严谨设计的临床试验证实。
旋覆花汤出自东汉医家张仲景《金匮要略·五脏风寒积聚病脉证并治》，原文记载：“肝着，其人常欲蹈其胸上。先未苦时，但欲饮热，旋覆花汤主之。旋覆花三两，葱十四茎，新绛少许，上三味，以水三升，煮取一升，顿服之”。肝主藏血，性喜疏泄，肝着者，气郁血结，着而不行也。方中旋覆花善通肝络而行气，葱白温通阳气，新绛活血化瘀，诸药合用可使气舒血行，阳通瘀化，则肝着之证可愈。在NAFLD/NASH发展过程中，过食肥甘、情志失调等诸多因素均可引起脾虚或肝郁，而脾虚肝郁所致的痰湿往往是本病早期的病机。但随着疾病的进一步发展，可导致痰湿阻络，气血郁滞[7]。因此，旋覆花汤“活血化瘀、疏肝通络”之功与本病发展过程中的“气郁血瘀”病机相对应。临床也常将本方作为基础方进行加减治疗“气郁血瘀”证肝病，如NAFLD/NASH、肝纤维化/肝硬化[21-22]。动物实验研究[23-25]发现，旋覆花汤可显著改善四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化胶原沉积、二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化肝窦毛细血管化以及脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤，但在NAFLD/NASH方面的研究有待进一步探讨。
在NASH进展过程中，肝脏可相继或合并出现脂质代谢紊乱、炎症反应及纤维化[26-27]。本研究发现旋覆花汤可显著改善高脂高果糖高胆固醇饮食诱导小鼠NASH的脂质沉积、炎症及纤维化。在NASH发生发展过程中，脂质代谢紊乱可使肝脏TG合成增加，游离脂肪酸摄取增多，进而导致肝脏脂质沉积[28]。旋覆花汤可明显改善肝细胞脂肪变、气球样变性和脂滴沉积，减少肝组织TG含量，以及显著降低肝组织脂质代谢相关SREBP-1c、FASN、SCD1、PPARγ和CD36 mRNA表达。有研究[29]认为NASH也是一种炎症性疾病，在NASH发病阶段，肝内炎症反应异常增强。该方可显著改善NASH小鼠血清AST和ALT活性，减轻肝组织小叶内炎症，以及显著降低炎症相关F4/80蛋白和F4/80、TNFα、CCL2及CD11b mRNA的表达。NASH进展期肝纤维化是NASH进展的主要决定因素，而肝纤维化程度则是决定NAFLD患者预后的重要影响因素[30]。旋覆花汤对NASH纤维化也具有较好的抑制作用，其可明显减轻NASH小鼠肝脏胶原纤维增生、肝组织Hyp含量以及肝脏纤维化相关蛋白和基因α-SMA的表达。本研究阳性对照药物法尼醇X受体激动剂奥贝胆酸在糖脂代谢、胆汁酸代谢以及肝脏炎症、纤维化等方面发挥着重要的调节作用[31-32]，其对高脂高果糖高胆固醇饮食诱导的NASH显示出较好的干预作用，但在血清TG含量、组织PPARγ、SREBP-1c、CD11b及CCL2 mRNA表达等指标上，效果不及旋覆花汤显著，这可能与中药复方多成分、多途径及多靶点作用相关。
综上所述，旋覆花汤可有效改善高脂高果糖高胆固醇饮食诱导的小鼠NASH，其作用机制可能与改善肝脏脂质代谢、炎症及纤维化有关，但深入的分子机制有待进一步研究。
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注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。
图 1 各组小鼠肝组织HE染色(×100)
Figure 1. HE staining of liver tissue in mice of each group (×100)
注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。
图 2 各组小鼠肝组织油红O染色(×50)
Figure 2. Oil red O staining of liver tissue in mice of each group (×50)
注：a，正常组；b，模型组；c，旋覆花汤组；d，奥贝胆酸组。
图 3 各组小鼠肝组织F4/80免疫组化染色(×100)
Figure 3. F4/80 immunohistochemical staining of liver tissue in mice of each group (×100)
图 4 各组小鼠肝组织天狼星红染色、Masson染色及α-SMA免疫组化染色结果(×100)
Figure 4. Sirius red staining, Masson staining and α-SMA immunohistochemical staining in mice of each group (×100)
表 1 PCR引物序列
Table 1. PCR Primer sequence
基因 引物序列 GAPDH 上游 5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3′ 下游 5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′ CD36 上游 5′-GGACATTGAGATTCTTTTCCTCTG-3′ 下游 5′-GCAAAGGCATTGGCTGGAAGAAC-3′ SREBP-1c 上游 5′-CGACTACATCCGCTTCTTGCAG-3′ 下游 5′-CCTCCATAGACACATCTGTGCC-3′ FASN 上游 5′-CACAGTGCTCAAAGGACATGCC-3′ 下游 5′-CACCAGGTGTAGTGCCTTCCTC-3′ SCD1 上游 5′-GCAAGCTCTACACCTGCCTCTT-3′ 下游 5′-CGTGCCTTGTAAGTTCTGTGGC-3′ PPARγ 上游 5′-GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGCC-3′ 下游 5′-ATCTCCGCCAACAGCTTCTCCT-3′ F4/80 上游 5′-CGTGTTGTTGGTGGCACTGTGA-3′ 下游 5′-CCACATCAGTGTTCCAGGAGAC-3′ CD11b 上游 5′-TACTTCGGGCAGTCTCTGAGTG-3′ 下游 5′-ATGGTTGCCTCCAGTCTCAGCA-3′ TNFα 上游 5′-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3′ 下游 5′-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3′ CCL2 上游 5′-GCTACAAGAGGATCACCAGCAG-3′ 下游 5′-GTCTGGACCCATTCCTTCTTGG-3′ α-SMA 上游 5′-TGCTGACAGAGGCACCACTGAA-3′ 下游 5′-CAGTTGTACGTCCAGAGGCATAG-3′ 注：GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；CD36，脂肪酸转运蛋白；SREBP-1c，固醇调节元件结合蛋白-1c；FASN，脂肪酸合酶；SCD1，正硬脂酰辅酶A去饱和酶1；PPARγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ；F4/80，小鼠含生长因子样模体黏液样激素样受体；CD11b，分化抗原簇分子11b；TNFα，肿瘤坏死因子α；CCL2，趋化因子配体2；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白。 
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表 2 各组小鼠体质量和肝湿重结果比较
Table 2. Comparison of body weight and liver wet weight of mice in each group
组别 动物数(只) 体质量(g) 肝湿重(g) 正常组 8 33.90±1.60 1.26±0.07 模型组 8 43.78±3.321) 3.33±0.591) 旋覆花汤组 8 41.30±2.83 2.74±0.58 奥贝胆酸组 8 41.95±3.72 2.81±0.59 F值 12.825 18.230 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01。
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表 3 各组小鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C及葡萄糖水平变化
Table 3. Changes of serum ALT, AST, TC, TG and glucose levels in mice of each group
组别 动物数(只) ALT (U/L) AST (U/L) 葡萄糖(mmol/L) TC (mmol/L) TG (mmol/L) LDL-C (mmol/L) 正常组 8 32.83±6.82 139.67±16.88 5.45±1.27 3.61±0.39 0.85±0.07 0.21±0.02 模型组 8 348.67±89.131) 392.83±66.621) 8.22±0.831) 9.83±1.221) 1.28±0.121) 1.28±0.051) 旋覆花汤组 8 191.50±67.293) 279.67±62.733) 6.32±1.482) 6.96±0.993) 1.03±0.183) 1.03±0.072) 奥贝胆酸组 8 239.67±67.753) 282.33±80.343) 6.53±0.882) 6.73±0.873) 1.08±0.172) 0.87±0.072) F值 24.153 17.082 6.095 45.951 9.021 78.603 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.004 ＜0.001 0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。
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表 4 各组小鼠肝脏病理学NAS
Table 4. NAS of liver pathology in mice of each group
组别 动物数(只) 肝细胞脂肪变(分) 小叶内炎症(分) 肝细胞气球样变(分) 总分 正常组 8 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 模型组 8 3.00±0.001) 1.83±0.751) 2.00±0.001) 6.83±0.751) 旋覆花汤组 8 1.83±0.753) 0.83±0.413) 1.00±0.632) 3.67±1.212) 奥贝胆酸组 8 2.00±0.893) 1.00±0.632) 1.17±0.752) 4.17±1.472) F值 27.439 11.961 14.314 45.951 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。
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表 5 各组小鼠肝组织油红O染色面积百分比和肝脏TG含量
Table 5. Oil red O staining area ratio and hepatic TG content of mice in each group
组别 动物数(只) 油红O染色面积百分比(%) 肝组织TG (μg/g) 正常组 8 0.70±0.31 47.94±17.33 模型组 8 41.48±4.321) 172.34±22.501) 旋覆花汤组 8 24.76±6.562) 115.98±24.813) 奥贝胆酸组 8 27.75±7.392) 127.22±24.913) F值 59.233 31.058 P值 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。
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表 6 各组小鼠脂质代谢相关基因表达
Table 6. The expressions of lipid metabolism related genes in mice of each group
组别 动物数(只) PPARγ mRNA相对表达量 CD36 mRNA相对表达量 SCD1 mRNA相对表达量 FASN mRNA相对表达量 SREBP-1c mRNA相对表达量 正常组 8 1.00±0.06 1.00±0.05 1.00±0.16 1.00±0.19 1.00±0.10 模型组 8 2.44±0.372) 2.70±0.252) 2.93±0.102) 2.64±1.692) 2.63±0.411) 旋覆花汤组 8 1.62±0.213) 1.96±0.084) 2.00±0.094) 1.20±0.453) 1.35±0.353) 奥贝胆酸组 8 1.78±0.31 1.87±0.134) 2.10±0.194) 1.40±0.543) 1.76±0.16 F值 29.605 21.404 31.045 3.878 6.034 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.025 0.004 注：与正常组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与模型组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01。
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表 7 各组小鼠肝脏炎症相关基因和蛋白表达
Table 7. The expressions of hepatic inflammation related genes and protein in each group
组别 动物数(只) mRNA相对表达量 F4/80蛋白阳性面积百分比(%) TNFα CD11b CCL2 F4/80 正常组 8 1.00±0.18 1.00±0.38 1.00±0.16 1.00±0.19 2.11±0.62 模型组 8 3.78±0.671) 3.33±0.231) 2.93±0.101) 2.64±1.691) 6.38±0.451) 旋覆花汤组 8 2.28±0.433) 2.22±0.743) 2.00±0.093) 1.20±0.453) 3.40±0.673) 奥贝胆酸组 8 2.49±0.613) 2.54±0.472) 2.10±0.19 1.40±0.543) 3.97±0.543) F值 30.138 23.167 14.449 12.761 28.787 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.05；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。
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表 8 各组小鼠肝组织Hyp含量、α-SMA免疫组化染色阳性面积百分比和基因表达
Table 8. Hepatic Hyp content, percentage of positive area of α-SMA immunohistochemical staining and gene expression in mice of each group
组别 动物数(只) 肝组织Hyp (μg/g) α-SMA阳性面积百分比(%) α-SMA mRNA相对表达量 正常组 8 244.74±36.72 1.21±0.16 1.00±0.27 模型组 8 574.01±54.401) 4.88±0.651) 2.75±0.721) 旋覆花汤组 8 446.15±57.732) 2.23±0.102) 1.69±0.442) 奥贝胆酸组 8 464.48±79.082) 2.87±0.312) 1.92±0.262) F值 32.530 51.894 14.650 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 注：与正常组比较，1)P＜0.05；与模型组比较，2)P＜0.01。
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