原发性肝癌在我国的发病率位居常见恶性肿瘤的第4位，是肿瘤致死的第2病因，严重威胁人民的生命和健康。其中，肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的大部分(＞80%)^[1]。目前，临床常用的治疗方法为手术切除，在HCC的治疗中疗效确切。肿瘤外科治疗的主要目标是实现肿瘤的完全切除，但是有些患者出现原发灶切除不完全(阳性切缘)，以及切除时未能切除肝脏中所有的病灶(隐匿性病灶)，并且与较低的生存率和较高的复发率密切相关^[2]。因此，需要利用术前或术中的成像技术来定位HCC，并保证完全切除。

以往常基于磁共振成像(MRI)或电子计算机断层扫描(CT)来帮助定位肿瘤，但这两种技术没有足够的分辨率来确定切除边缘。此外，在术中检测手术切缘的常用技术是冰冻切片，但这是一个耗时并且昂贵的方法，并且由于取材的位置会造成此项检测容易出现假阴性。另外，术中超声虽能很好反映肿瘤周围的结构并确定切肝线，但这种技术需要专业的超声科医师，而且超声探头频繁介入不仅影响手术连贯性，耽误时间，而且无法真正做到全程实时成像指导手术。因此，迫切需要一种实时、安全和可靠的成像技术来实现HCC的准确定位和完整切除。

术中近红外荧光(near-infrared fluorescence，NIRF)成像技术是一种使用方便、安全、成本低的可视化成像技术，在指导外科手术中得到了广泛的研究。NIRF成像技术主要基于近红外一区(NIR-Ⅰ, 700~900 nm)和近红外二区(NIR-Ⅱ, 1000~1700 nm)光学波段^[3-5]。与可见光相比，生物组织对近红外波段内光的吸收和散射较少，生物自发荧光较弱，这使得NIRF成像技术具有时空分辨率高、对生物组织损伤小、背景荧光干扰小等优点，在提供生理和病理信息方面具有显著的优势。本文总结了各种NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ荧光探针在HCC肝切除术中的临床前研究和临床应用的最新进展，对这些探针在不久的将来在肝脏手术中的应用进行展望。

1.   NIR-Ⅰ荧光成像

1.1   用于临床的NIR-Ⅰ荧光探针

1.1.1   吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)

ICG是美国食品药品监督管理局(FDA)批准临床使用的NIRF染料。静脉注射ICG进入体循环后，ICG与血浆中的白蛋白、脂蛋白等高分子蛋白结合，既不被代谢分解，也不会改变被结合蛋白的分子结构，具有良好的血管内稳定性。ICG分子通过肝细胞活跃的主动转运系统被肝细胞特异性摄取，随后分泌至胆道系统最终通过肠道排出体外，不存在肠肝循环，使用较为安全^[6]。实验研究表明，荧光在穿透生物组织的过程中，绝大多数光线被血红蛋白(波长＜700 nm)和水分(波长＞900 nm)吸收中和。ICG分子被波长750~810 nm的光线激发后，发射峰值波长为840 nm的荧光，该荧光波长位于深红和近红外线光谱的“窗口”界限(700~900 nm)内，因而具有较大的组织穿透力。

正常肝组织可在12~24 h内彻底清除ICG，由于肿瘤组织的“高渗透长滞留效应”以及HCC组织中肝细胞的胆汁排泄功能受损，静脉注射后ICG在肿瘤组织中残留数周，在术中激发光照射下显示肿瘤组织荧光^[7]。ICG在HCC中聚集的现象在2007年被偶然发现，随后Ishizawa等^[8]开展的一项前瞻性研究发现ICG荧光成像识别了所有63例术后病理确诊的HCC，其中，有8例术前被漏诊而被ICG成功识别。除了肝内HCC，Satou等^[9]在2013年报道，利用ICG成功识别了包括腹膜、淋巴结、肺和肾上腺转移的病理证实为HCC的肝外转移灶。同年，Morita等^[10]初步探讨了ICG荧光成像能否改善HCC患者的预后。通过对58例接受术中ICG荧光引导切除术的HCC患者的随访发现，这些患者术后12个月内的短期复发率较对照组有降低的趋势。Ishizawa等^[7]在2014年的进一步研究显示通过ICG荧光成像识别出276个HCC中的273个，灵敏度为99%。此外，研究^[11]还发现ICG的显像模式与HCC的分化程度密切相关。低分化的HCC呈环状荧光模式，而高分化和中等分化的HCC分别具有完全和部分荧光模式。分化型HCC保留了摄取ICG的能力，但由于缺乏正常的胆管结构，使得ICG在肿瘤组织内积聚滞留, 显示出部分荧光。低分化或转移性肝癌细胞虽不摄取ICG，但肿瘤的压迫干扰癌旁肝脏组织ICG通过胆管分泌，在不同程度上影响癌旁肝组织ICG的正常清除，从而显示环形荧光。最近，Zhang等^[12]证明了术中ICG近红外荧光检测对于识别体积小且难以肉眼观察到的HCC的巨大潜力，检测到的最小HCC结节直径约为2 mm。

解剖性肝切除术能显著降低HCC的术后复发率，改善患者预后^[13]。术中肝段解剖界限的确定是解剖性肝切除术的技术关键，既往常用的技术是根据肝蒂阻断后肝表面缺血线，以及术中超声引导下穿刺门静脉分支内注射亚甲蓝使目标肝段蓝染来指导解剖性肝段切除术^[14]。但这两种方法精确性较差、难以确定肝段的立体界面，且标记持续时间较为短暂。有研究^[15-16]报道在解剖性肝切除术中比较经门静脉注射ICG荧光染料与亚甲蓝界定肝段、指导解剖性肝切除的实际应用效果，结果发现ICG荧光染料能更清楚、方便和持久地显示荷瘤肝段在肝实质的三维界限，认为ICG荧光导航可安全、有效地应用于解剖性肝切除术。ICG给药途径的不同，对目标肝段的荧光标志效果也相应不同，因此将肝段荧光染色的方法分为“正染”和“负染”。“正染”是指在目标肝段的门静脉(或肝动脉)分支里注射ICG，ICG在该肝段肝实质内的近红外线激发后发出荧光，目标肝段的荧光染色可指导解剖性肝切除术；“负染”是指术中选择性阻断目标肝段的肝蒂血流后，从外周静脉内注射ICG，使除目标肝段外的有血供肝脏实质内ICG荧光显影，而目标肝段无荧光染色获得反衬效果。近年来，越来越多的研究^[17-20]报道了涉及使用ICG近红外荧光成像的正染或负染方法开展的解剖性肝切除术。因此，ICG荧光染色确定肝段解剖界限，实现术中实时肝段可视化，可极大地辅助肝解剖性切除的顺利实施。

目前，ICG荧光成像在HCC肝切除术中的应用仍存在两大局限。一是有限的组织穿透深度。据报道^[21]，ICG被激发后发射的荧光在组织内的穿透深度大约为10 mm，距肝表面10 mm以上的肿瘤很难被识别。另一个局限性是HCC结节的高假阳性检出率。我国HCC患者大部分同时伴有肝硬化，而肝硬化的再生结节也可显示较强的荧光导致40%~50%的假阳性率^[22]。

1.1.2   5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)

另一个临床上用于肿瘤诊断的NIR-Ⅰ荧光染料是5-ALA，5-ALA是人体血红素生物合成途径中原卟啉的前体物质。正常情况下，体内5-ALA水平受到血红素合成的负反馈调节，保持动态平衡的状态，细胞内不会蓄积过多的5-ALA。当大量外源性5-ALA进入机体时，这种负反馈平衡会被打破，导致细胞中原卟啉的过度积累。而原卟啉在波长为405 nm的蓝紫色光的激发下可在630 nm的可见光谱内检测到红色荧光。原卟啉在肿瘤细胞和正常细胞中的分解速度不同，在正常细胞中，原卟啉在2~4 h可彻底降解，而在肿瘤细胞中则需要12~24 h。因此经激发光激发后，原卟啉过度累积的肿瘤细胞在视觉上就可与原卟啉含量较少的正常组织区分开^[23]。2002年，Schneider等^[24]首次报道了利用5-ALA发现了几个肉眼观察不到的HCC转移灶。2016年，Kaibori等^[25]比较了ICG和5-ALA两种荧光染料在术中检测浅表肝肿瘤的应用。结果显示5-ALA和ICG检测术前确定的主要肿瘤的敏感度分别为57%和96%，特异度分别为100%和50%。据报道^[26]低血压和肝功能异常是口服5-ALA的潜在不良反应，因此ICG与5-ALA相比的主要优势在于其安全性和商业可用性。

1.2   用于临床前研究的NIR-Ⅰ荧光探针

由于靶向性不足，ICG在HCC成像应用中存在一定的局限性。为了提高HCC的靶向性以及NIRF对肿瘤和背景信号的比值(T/B值)，越来越多的研究通过对常规NIRF染料的结构修饰、偶联肿瘤的靶向配体以及纳米修饰等策略，研发了一些具有HCC诊断优势的NIR-Ⅰ荧光探针。由于需要从有效性、安全性和伦理学角度进行评估，新开发的NIR-Ⅰ荧光探针进入临床实践需要很长时间。大多数用于HCC成像的NIR-Ⅰ荧光探针仍处于临床前研究阶段。

1.2.1   有机染料

由于肿瘤线粒体膜电位比正常细胞膜电位高，使得花青素类染料可以直接聚集于肿瘤部位，发挥肿瘤靶向作用^[27]。Shi等^[28]研究了IR-783在人肝癌细胞HepG2荷瘤小鼠中的成像应用。结果显示IR-783特异性聚集在肿瘤部位，能够清晰地识别肿瘤边缘，并且NIRF强度随肿瘤体积的增大而增强。2018年，Shi等^[29]又发现MHI-148染料可特异性集聚于体外培养的HCC细胞，肝癌皮下荷瘤鼠注射MHI-148染料24 h后T/B值逐渐增加，并在24 h达到峰值。但对于临床应用来说，肿瘤靶向NIRF染料的整体表现尚不理想，例如溶解性差，生物相容性等问题亟待解决。因此，研发水溶性好、毒性低和肿瘤特异性好的NIRF染料将是HCC非侵入性诊断的方向。

1.2.2   偶联肿瘤靶向配体的荧光探针

荧光染料的肿瘤靶向性对于肿瘤检测的特异性和敏感性至关重要。然而，大部分的NIRF探针并不具备或仅有极低的靶向能力，这就限制了NIRF染料在肿瘤显像中的应用。通常NIRF染料需要与肿瘤特异性配体的结合实现对肿瘤的主动靶向性。这些特异性配体包括化学分子、肽、蛋白质、抗体和核酸适配体等，能够特异性地识别肿瘤细胞相关的生物标志物。2011年，Li等^[30]首次证明精子蛋白17在HCC细胞系SMMC-7721中过表达，与ICG偶联的抗精子蛋白17单克隆抗体可用于体内HCC成像。已知CD24在包括HCC在内的多种人类肿瘤中过表达，2015年He等^[31]将CD24靶向抗体G7mAb和G7S偶联NIRF染料，并在HCC异种移植组织中观察到特异性NIRF成像。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)的表达在HCC中显著升高，但在胆管癌或正常肝组织或血清中没有显著升高。Zhu等^[32]和Qin等^[33]将NIRF染料Cy5.5标记的GPC3结合肽静脉注射到HepG2荷瘤小鼠体内后，成功区分HCC组织与正常肝组织。

1.2.3   纳米探针

随着纳米技术的进展，基于纳米材料的NIRF分子探针可以通过增强肿瘤微血管系统的通透和滞留作用，或通过与肿瘤相关配体的特异性结合靶向到肿瘤^[34]。2016年，Zeng等^[35]合成了一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸共轭介孔二氧化硅纳米颗粒，其高度负载ICG，可以准确描绘肝癌边缘并在术中提供精确的肿瘤与正常组织荧光强度对比。增加的ICG负载能力和肿瘤特异性使得能够识别活体小鼠中＜1 mm的残留微肿瘤和卫星病变。虽然纳米颗粒是用于肿瘤特异性成像的较好方式，但由于其潜在的系统性毒性以及稳定性限制了其广泛应用，目前纳米NIRF染料的应用仅限于细胞水平和实验动物。因此，开发具有可生物降解或表面包裹的纳米颗粒材料，如磷酸钙、低密度脂蛋白和聚合物等纳米粒子的NIRF将成为未来研究的方向。

2.   NIR-Ⅱ荧光成像

2.1   用于临床的NIR-Ⅱ荧光探针

与传统的近红外窗口(NIR-Ⅰ，750~900 nm)相比，NIR-Ⅱ荧光利用其长波长的优势，减少了光子散射，减少了自发荧光，使光子能够穿透更深的生物组织，提高空间分辨率，可明显提高肿瘤成像的效果^[36]。然而，由于缺乏合适的成像仪器和光学探针，NIR-Ⅱ荧光成像尚未在临床实践中得到应用。最近研究^[37]发现ICG在NIR-Ⅱ范围内也可显示荧光，并已被证明适用于小动物模型中的NIR-Ⅱ成像。Hu等^[38]开发了一种集成的可见光和NIR-Ⅰ/Ⅱ多光谱成像仪器，并表征了不同红外窗口下人类和动物研究的成像性能。此外，在ICG注射后的23例肝肿瘤患者中进行了可见光、NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ多光谱成像的首次人体研究。对于所有HCC患者(n=11)，NIR-Ⅱ成像比NIR-Ⅰ成像显著提高了肿瘤与正常组织荧光强度的比值以及更高的灵敏度和阳性预测值。值得注意的是，NIR-Ⅰ成像需要避光，而NIR-Ⅱ成像则不需要。NIR-Ⅱ成像与手术室照明环境兼容，为临床应用提供了便利性和可行性。

2.2   用于临床前研究的NIR-Ⅱ荧光探针

尽管NIR-Ⅱ荧光探针具有其显著优势，同时还丰富了在NIR-Ⅱ生物成像领域的探索和应用，但目前的研究主要集中在基础研究上。Ding等^[39]开发了一种自组装的NIR-Ⅱ荧光探针(SCH1~SCH4)，SCH4在小鼠HCC模型中显示出快速的肿瘤摄取和较高的肿瘤/正常组织的信号比(＞7)，能够促进精确的图像引导肿瘤手术，并且还首次展示了在NIR-Ⅱ窗口中检测肝纤维化。此外，Ren等^[40]报道了一种稀土掺杂的NIR-Ⅱ荧光探针(Gd-REs@Lips)。对HCC的人源肿瘤异种移植小鼠模型成像研究表明，Gd-REs@Lips在体内表现出良好的T₂对比效果，NIR-Ⅱ荧光成像在肝表面检测到最小病灶直径为2 mm的卫星病灶。最近，Zhang课题组^[41]合成了一种肿瘤微环境中过氧亚硝酸盐(ONOO^-)响应的NIR-Ⅱ染料MY-1057，它可以通过基于荧光寿命成像准确检测单个和多个HCC。NIR-Ⅱ荧光成像的研究仍处于起步阶段，有必要进一步开发发射波长可调、量子产率高、生物毒性低的新型NIR-Ⅱ荧光探针。然而，由于未见报道临床批准的NIR-Ⅱ荧光染料，因此尚无新的探针用于NIR-Ⅱ临床手术导航。

3.   当前挑战和未来展望

ICG和亚甲蓝是美国FDA批准的唯一可用的NIR荧光团^[42]。亚甲蓝由于其非特异性和有限的量子产率，尚未于常规手术应用。虽然有报道ICG可以实现HCC的NIR-Ⅰ/Ⅱ荧光成像，但作为非靶向探针，ICG肿瘤显像的高假阳性率限制了其应用发展。目前限制其进一步临床应用的问题为NIRF染料不具有靶向性以及水溶性差。靶向NIRF探针需要NIR荧光团和靶向分子稳定结合，才能实现靶向肿瘤细胞的荧光成像。目前还缺乏针对HCC的NIRF成像的临床试验；更重要的是，对于HCC的最佳生物标志物尚无明确共识。HCC的早期检测和新型靶向NIRF探针的开发迫切需要分子靶标。

与NIR-Ⅰ成像相比，NIR-Ⅱ荧光成像具有更深的成像深度，并且具有较少的自发荧光的干扰。然而，在临床环境中实施NIR-Ⅱ成像之前，仍有一些障碍需要克服。首先，目前的NIR-Ⅱ荧光分子大部分生理稳定性差且具有疏水性，此外，其中一些分子是无机荧光团，毒性大，代谢缓慢，不针对特定组织；其次，各种分子相互作用导致猝灭，导致荧光分子发出的光减少；第三，目前只有少数NIR-Ⅱ成像系统可用，这些系统的开发成本非常高。最重要的是，目前只有临床前NIR-Ⅱ荧光探针可用，将临床前研究转化为临床环境是一个漫长的过程。因此，临床应用可能还很遥远。

在肝切除术中，减少正常结构损伤和去除所有肿瘤组织对HCC患者至关重要。迄今为止，NIRF成像已显示出其应用于外科手术的巨大潜力以及改善临床预后的可行性。NIR-Ⅰ荧光成像在HCC肝切除术中进展迅速，但仍缺乏靶向探针的临床试验。随着临床前研究的不断增加，NIR-Ⅱ成像已经到了一个关键的转折点。伴随新的成像技术以及成像设备的不断发展，NIRF成像的研究范围将不断扩大，未来可能真正实现手术导航，帮助外科医生进行术中决策，为HCC的诊疗提供一种崭新的方法。