PDF下载 ( 2184 KB)
下瘀血汤对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的治疗作用及机制
DOI: 10.12449/JCH240412
Therapeutic effect of Xiayuxue decoction on a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet and its mechanism
-
摘要:
目的 探讨下瘀血汤调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6（NLRP6）抑制高脂饮食（HFD）诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的作用机制。 方法 15只雄性C57BL/6小鼠随机分为低脂饮食（LFD）组、HFD组和下瘀血汤-HFD（XYXD）组，每组各5只。测量肝功能指标ALT和AST、血脂代谢指标TG、TC水平；肝组织经过HE染色、油红O染色，观察小鼠组织形态、脂滴沉积；实时荧光定量PCR检测肝组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NLRP6表达水平；Western Blot检测NLRP6、NF-κB和NF-κB p65蛋白水平；免疫组化检测NLRP6和CD68表达。棕榈酸（PA）、脂多糖（LPS）和下瘀血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞，检测炎症情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与LFD组比较，HFD组血清ALT、AST和TC、TG水平显著升高（P值均<0.05）。肝组织病理学显示，HFD组肝脂肪变性明显，NAS评分显著升高（P<0.05）；实时荧光定量PCR结果显示，IL-1β、IL-18等炎症相关因子显著升高，NLRP6表达显著下调（P值均<0.05）。免疫组化显示NLRP6表达与巨噬细胞标志物CD68重合。Western Blot显示，NLRP6表达下调后，磷酸化的NF-κB p65（p-NF-κB p65）显著上调（P<0.05）。与HFD组相比，下瘀血汤可有效改善HFD小鼠的肝脏炎症，上调NLRP6的表达，下调p-NF-κB p65（P<0.05）。PA处理Raw264.7细胞后下调NLRP6，促进炎症进展（P<0.05）；下瘀血汤处理可上调NLRP6，抑制炎症和NF-κB（P<0.05）。 结论 下瘀血汤可显著改善HFD诱导NAFLD小鼠模型的肝脂肪变性和炎症，调控NLRP6/NF-κB减轻巨噬细胞活化可能是其作用机制之一。 -
关键词:
- 非酒精性脂肪性肝病 /
- 下瘀血汤 /
- 巨噬细胞 /
- NLR蛋白质类 /
- 小鼠， 近交C57BL
Abstract:Objective To investigate the mechanism of action of Xiayuxue decoction in inhibiting nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） induced by high-fat diet in mice by regulating nucleotide binding oligomerization domain like receptor containing pyrin domain protein 6 （NLRP6）. Methods A total of 15 male C57BL/6 mice were randomly divided into low-fat diet （LFD） group， high-fat diet （HFD） group， and Xiayuxue decoction-HFD group （XYXD group）， with 5 mice in each group. Liver function parameters （alanine aminotransferase ［ALT］ and aspartate aminotransferase ［AST］） and blood lipid metabolic indicators （triglycerides ［TG］ and total cholesterol ［TC］） were measured； HE staining and oil red O staining were performed for liver tissue to observe histomorpholoty and lipid droplet deposition； quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of inflammatory factors （tumor necrosis factor-α ［TNF-α］， interleukin-1β ［IL-1β］， interleukin-18 ［IL-18］， and NLRP6） in liver tissue； Western blot was used to measure the protein expression levels of NLRP6， nuclear factor-kappa B （NF-κB）， and NF-κB p65； immunohistochemistry was used to measure the expression of NLRP6 and CD68. Mouse Raw264.7 cells were treated with palmitic acid （PA）， lipopolysaccharide， and serum containing Xiayuxue decoction to observe inflammation. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the LFD group， the HFD group had significant increases in the serum levels of ALT， AST， TC， and TG （all P<0.05）. Liver histopathological examination showed that the HFD group had marked hepatic steatosis and a signficant increase in NAS score （P<0.05）， and quantitative real-time PCR showed significant increases in the inflammatory factors such as IL1β and IL-18 and a significant reduction in the expression of NLRP6 （all P<0.05）. Immunohistochemistry showed that the expression of NLRP6 showed a similar trend as that of the macrophage marker CD68. Western blot showed that after the downregulation of NLRP6 expression， there was a significant increase in phosphorylated NF-κB p65 （P<0.05）. Compared with the HFD group， Xiayuxue decoction effectively improved liver inflammation， upregulated the expression of NLRP6， and downregulated phosphorylated NF-κB p65 in HFD mice （all P<0.05）. After Raw264.7 cells were treated with PA， NLRP6 was downregulated to promote the progression of inflammation （P<0.05）， and treatment with Xiayuxue decoction could upregulate NLRP6 and inhibit inflammation NF-κB （P<0.05）. Conclusion Xiayuxue decoction can effectively improve hepatic steatosis and liver inflammation in a mouse model of NAFLD， possibly by regulating NLRP6/NF-κB to alleviate macrophage activation. -
Key words:
- Non-alcoholic Fatty Liver Disease /
- Xia Yu Xue Tang /
- Macrophages /
- NLR Proteins /
- Mice， Inbred C57BL
-
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精、肝炎病毒、药物等其他明确的肝损因素所致的，伴或不伴炎症为主要病理特征的遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征，最终可发生纤维化、原发性肝癌［1］。我国NAFLD发病率增长快速［2］，在医疗支出等多方面给社会带来巨大的经济负担，但尚无特效治疗药物。
下瘀血汤出自东汉医圣张仲景之《金匮要略》，临床可用于治疗慢性肝炎、肝硬化、盆腔炎、肥胖症等。前期笔者［3］研究已经发现下瘀血汤可显著改善蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型的脂肪变和炎症。为进一步探究核苷酸结合寡聚化结构域样受体含pyrin结构域蛋白6（nucleotidebinding oligomerization-domain protein-like receptors protein 6，NLRP6）是否是下瘀血汤改善NAFLD的治疗靶标，本研究进一步建立高脂饮食（HFD）NAFLD小鼠模型，培养鼠Raw264.7细胞，以阐明下瘀血汤治疗NAFLD的作用机制。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
清洁级C57BL/6雄性小鼠，6～8周龄，18～21 g，购自上海斯莱克实验动物公司，生产许可证号：SYXK（沪）2017-0005。小鼠饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心，使用许可证号：SYXK（沪）2018-0032。室温（22±1）℃，湿度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，小鼠自由进食和饮水。
1.1.2 细胞培养方法
鼠巨噬细胞Raw246.7培养于10 cm培养皿，1640培养基以10%FBS+1%双抗混匀，棕榈酸（PA）200 μmol/L和/或下瘀血汤含药血清和/或脂多糖（LPS）10 ng/mL处理2～48 h。
1.1.3 药物与试剂
下瘀血汤所含的生药大黄、桃仁、地鳖虫均购自上海华宇药业有限公司，有明确的原产地并经生药学专家鉴定，由上海中医药大学附属曙光医院制备：大黄2.0 kg，桃仁2.0 kg，地鳖虫1.2 kg，分别制成粗粉末，分别加20%乙醇8倍量，浸泡1 h，回流提取2次，第一次加20%乙醇回流提取30 min，滤过取汁；药渣再加6倍量20%乙醇回流提取1 h，滤过取汁，合并2次提取液。
1.1.4 试剂及耗材
ALT（型号：C009-1）、TG（型号：P001）、TC（型号：P002）等试剂盒购自南京建成有限公司；RNA抽提Trizol（型号：9109）、High-Capacity cDNA反转录试剂盒（型号：RR037A）及SYBR荧光染料（型号：RR420）购自日本TAKARA公司；天狼星红购自北京雷根生物技术有限公司（型号：BD1150），油红购自国药集团化学试剂有限公司（型号：20161128）；SABC免疫组化试剂盒购自Vector公司；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自联科生物；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo scientific公司（型号：23227）；PVDF膜购自Merck Millipore公司（型号：IPVH00010）；NLRP6抗体购自Biorbyt公司（型号：P59044）；CD68抗体购自Abcam公司（型号：ab31630）。
1.1.5 主要仪器
超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所，型号：JY92-II）；多功能酶标仪（美国Thermo Varioskan LUX，序列号：3020-269），超微量分光光度计（Berthold Detection Systems，型号：colibri），普通PCR仪（Bio-RAD，型号：T100），实时荧光定量PCR仪（ABI公司，型号：VIIA 7 DX），电泳仪（Bio-Rad公司，型号：PowerPac TM Basic 041BR127719），化学发光凝胶成像分析系统（上海培清科技有限公司，型号：JS-1060），冰冻切片机（Leica公司，型号：CM1950），半自动轮转式切片机（Leica公司，型号：RM2245），自动脱水机（Leica公司，型号：TP1020），包埋机（Leica公司，型号：EG1150H），全自动染色机（Leica公司，型号：ST5010），自动封片机（Leica公司，型号：CV5030），荧光显微镜（Olympus，型号：BX43）。
1.2 分组及给药方法
15只雄性C57/BL6小鼠随机分为低脂饮食（LFD）组（n=5）、HFD组（n=5）、下瘀血汤治疗（XYXD）组（n=5）。HFD组采用南通特洛菲高脂饲料建模（饲料型号：TP 2330055A）：脂肪热量60%，蛋白质热量15%，碳水化合物热量25%，总热量为5.5 kcal/g。LFD组采用低脂饲料喂养（饲料型号：TP 2330055AC）：脂肪热量10%，蛋白质热量15%，碳水化合物热量75%，总热量为3.8 kcal/g。造模第6周起，下瘀血汤组小鼠给予下淤血汤0.467 8 g/kg（相当于临床70 kg成人体质量的10倍剂量）灌胃，对照组给予等体积蒸馏水，灌胃至24周末，1次/d。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 一般情况
观察实验过程中动物的进食量及体质量变化。
1.3.2 血清学及肝组织指标检测
采用相关试剂盒检测各组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平。
1.3.3 肝组织病理学观察
选取肝右侧最厚一叶，切取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小肝组织1块，10%中性福尔马林固定，自动脱水机逐级酒精脱水、二甲苯透明，包埋、4 μm切片，观察组织的病理变化。HE染色观察组织学的损伤，由本院病理科2位医师盲法阅片评估NAS评分［4］；油红染色：冰冻切片复温后PBS洗5 min×2次，60%异丙醇洗1 min，室温晾干，油红稀释液染色30 min，蒸馏水清洗5 min，PBS洗5 min，封片；免疫组化染色：石蜡切片脱蜡至水，1%柠檬酸钠抗原修复，3% H2O2室温孵育5～10 min，PBS清洗，3 min×3次，5% BSA封闭30 min，抗体CD68（1∶200）或NLRP6（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBS清洗，3 min×3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次；第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS清洗，3 min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，5% BSA封闭30 min，再次加入二次的抗体CD68（1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS清洗，滴加Vector双染试剂盒中二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗，AP（蓝色）显色液显色，水洗后苏木素复染，充分水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，封片。采用Image-pro plus 6.0软件分析病理图片的阳性染色区域。
1.3.4 实时荧光定量PCR
检测各组簇分化抗原68（CD68）、TNF-α、IL-1β、IL-18、NLRP6、Caspase蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相关微粒蛋白（ASC），引物由上海生工生物科技有限公司合成（表1）。总RNA的提取：按照Trizol法提取，将提取的总RNA溶解于DEPC处理的水中，采用超微量分光光度计测定260 nm和280 nm的吸光度值（A），检测RNA纯度，并计算RNA含量。逆转录合成cDNA：按TakaRa逆转录试剂盒说明书进行操作，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。PCR扩增：取cDNA 3 µL加SYBRGreen 5 µL，上引物0.4 µL，下引物0.4 µL，ddH2O 1.2 µL，制成10 µL反应体系，在Applied Biosystems实时荧光定量PCR系统中进行扩增反应。PCR扩增条件：95 ℃、30 min预变性；95 ℃、5 s变性，60 ℃、30 s退火，45个循环，和60 ℃、1 min延伸。PCR结束后，采用2-△△CT法分析结果，计算目的基因在各组的相对表达量。
表 1 引物序列表Table 1. Primer sequence table基因 上游（5′-3′） 下游（5′-3′） 18S GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG TNF-α ATGAGAGGGAGGCCATTTG CAGCCTCTTCTCATTCCTGC IL-1β AGGTCAAAGGTTTGGAAGCA TGAAGCAGCTATGGCAACTG CD68 ACATTGTATTCCACCGCCAT CATCCCCACCTGTCTCTC IL-18 AACCGCAGTAATACGGAGCA CTGGTCTGGGATTCGTTGG NLRP6 CTCGCTTGCTAGTGACTACAC AGTGCAAACAGCGTCTCGTT Caspase-1 ACAAGGCACGGGACCTATG TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG ASC TGAGCAGCTGCAAACGACTA AGGAGGAACAGTTAAGCGCC 1.3.5 Western Blot检测
0.1 mg肝组织加入预冷的RIPA（含蛋白酶抑制剂）匀浆，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清。取20 μg样品，12% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至PVDF膜，封闭1 h；一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育45 min，ECL显影，采用Image J分析Western Blot的蛋白表达灰度值。
1.3.6 酶联免疫吸附实验
使用商品化的ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的浓度。在预包被捕获抗体的孔板里，加入标准品和稀释的细胞上清样品，加入HRP标记的检测抗体，封板膜封板后37 ℃孵育1 h。充分洗涤后加入TMB显色液，37 ℃避光显色15 min后终止显色，使用酶标仪检测吸光度值，计算得出细胞上清液中IL-6和TNF-α的实际浓度。
1.3.7 细胞免疫荧光
培养及处理细胞，吸除培养基，用预冷的PBS洗涤。4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，使用0.5%Triton-X100透膜15 min，随后用5%BSA封闭1 h。在4 ℃孵育CD68抗体（abcam，1∶100）过夜，次日在室温避光孵育CY3荧光二抗1 h，上述各步骤间均使用PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察并拍照。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以
2. 结果
2.1 下瘀血汤对小鼠体质量的影响
实验过程中无动物死亡情况，3组小鼠进食量相近，组间小鼠体质量差异有统计学意义（F=29.62，P<0.001）。HFD组体质量（45.77±2.57）g，高于LFD组（30.90±2.82）g（P<0.001），XYXD组体质量（37.67±3.67）g低于HFD组（P=0.001）。
2.2 下瘀血汤对小鼠肝功能和血脂的影响
与LFD组相比，HFD组小鼠血清ALT、AST活性显著升高，XYXD组比HFD组ALT、AST活性显著降低（P值均<0.05）。与LFD组相比，HFD组小鼠血清TC、TG含量显著升高，XYXD组比HFD组TC、TG显著降低（P值均<0.05）（表2）。
表 2 各组小鼠血清转氨酶及血脂水平Table 2. Serum transaminase and blood lipid levels of mice in each group组别 动物数（只） ALT（U/L） AST（U/L） TC（μmol/L） TG（μmol/L） LFD组 5 7.94±3.15 4.31±2.63 1.19±0.08 0.53±0.19 HFD组 5 85.31±31.991） 52.06±19.451） 1.87±0.341） 2.68±1.291） XYXD组 5 23.17±8.572） 15.36±6.732） 1.34±0.232） 1.14±0.172） F值 22.76 21.77 10.08 10.49 P值 0.000 1 0.000 1 0.003 0.002 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。 2.3 下瘀血汤对小鼠脂肪变和炎症的影响
HE染色显示，LFD组肝小叶结构正常，肝细胞索围绕中央静脉这一中心呈放射状排列；HFD组见大量脂肪变，肝细胞气球样变，炎症细胞浸润；与HFD组相比，XYXD组脂肪变显著减轻（图1）。HFD组NAS积分显著高于LFD组（P<0.05），下瘀血汤组NAS积分比HFD组显著降低（P<0.05）（表3）。
图 1 各组小鼠HE染色、油红染色结果Figure 1. The results of HE staining and oil red staining in each group表 3 各组小鼠肝脏油红染色半定量及NAS评分比较Table 3. Semi quantitative oil red staining and NAS score of liver in each group of mice组别 动物数（只） 油红染色阳性面积（%） NAS评分 LFD组 5 0.83±0.26 1.33±0.21 HFD组 5 34.20±4.871） 5.50±0.431） XYXD组 5 6.27±1.202） 3.17±0.482） F值 34.52 28.72 P值 0.000 1 0.000 1 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。 油红染色显示，HFD组肝细胞内被大量红色脂滴填充，形状不规则的脂滴排列紧密，形态较大。油红染色阳性面积统计结果显示，与LFD组相比，HFD组油红阳染面积显著增加（P<0.05），XYXD组脂滴较HFD组稀疏减少（P<0.05）。
进一步通过实时荧光定量PCR检测相关炎症因子，结果显示与LFD组相比，HFD组TNF-α、IL-1β、IL18、CD68、Caspase-1、ASC的mRNA显著上升（P值均<0.05），NLRP6则显著下调（表4），提示NAFLD发展过程中，炎症因子分泌增加，NLRP6出现下调，其炎症小体组成成分Caspase-1和ASC上调，提示NLRP6不以炎症小体形式起作用。
表 4 各组小鼠肝组织中炎症相关因子mRNA相对表达量比较Table 4. Comparison of relative expression levels of inflammatory related factor mRNA in liver tissues of mice in each group组别 IL-1β TNF-α CD68 IL-18 NLRP6 Caspase-1 ASC LFD组 1.00±0.61 0.83±0.45 1.00±0.25 1.00±0.30 1.00±0.24 1.03±0.45 1.00±0.29 HFD组 2.63±0.661） 12.19±8.671） 3.81±2.911） 4.43±3.391） 0.41±0.251） 4.87±0.911） 2.50±1.141） XYXD组 1.56±0.992） 2.77±2.022） 1.56±0.412） 1.80±0.802） 0.76±0.302） 2.36±0.722） 1.43±0.882） F值 11.44 15.74 8.58 8.80 12.62 36.67 8.37 P值 0.000 2 0.000 1 0.001 0.001 0.000 1 <0.000 1 0.001 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。 2.4 下瘀血汤对小鼠肝巨噬细胞活化和NLRP6表达的影响
通过免疫组化染色检测巨噬细胞表面标志物CD68，显示HFD组肝巨噬细胞在肝脏中央静脉周围及脂肪细胞周围的浸润与LFD组相比显著增多（P<0.05）；XYXD组巨噬细胞活化数目则较HFD组显著减少（P<0.05）。同时，免疫组化染色检测NLRP6，相较LFD组，HFD组中NLRP6染色面积显著下调（P<0.05），而XYXD组NLRP6表达显著上调（P<0.05）。进一步共染CD68和NLRP6，发现两者染色区域存在部分重叠，验证了笔者的假设，即下瘀血汤通过上调NLRP6，减轻NAFLD中巨噬细胞的活化，减轻炎症（图2，表5）。
注： 黑色箭头表示CD68阳性，红色箭头表示NLRP6阳性。图 2 各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6表达（免疫组化，×400）Figure 2. Expression of CD68 and NLRP6 in liver tissue of mice in each group （IHC stain，×400）表 5 各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6含量半定量分析Table 5. Semiquantitative analysis of CD68 and NLRP6 content in liver tissue of mice in each group组别 CD68阳性面积（%） NLRP6阳性面积（%） LFD组 1.27±0.99 5.22±2.20 HFD组 11.11±3.901） 0.69±0.361） XYXD组 5.56±1.672） 3.84±2.17 F值 11.56 7.98 P值 0.009 0.020 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。 2.5 下瘀血汤对小鼠肝巨噬细胞NLRP6/NF-κB的影响
Western Blot结果显示，与LFD组比较，HFD组NLRP6蛋白表达下调（P<0.05），磷酸化的NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白上调（P<0.05）；与HFD组比较，XYXD组NLRP6蛋白表达上调（P<0.05），p-NF-κB p65蛋白显著下调（P<0.05）（图3，表6）。提示下瘀血汤可能通过抑制NLRP6/NF-κB的活化，减少相关炎症因子的释放。
表 6 各组小鼠肝组织中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析Table 6. Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in liver of mice in each group组别 p-NF-κB灰度值 NLRP6灰度值 LFD组 4.89±0.86 17.43±2.06 HFD组 23.31±2.441） 4.42±1.201） XYXD组 11.91±0.842） 14.52±2.212） F值 35.16 13.25 P值 0.000 1 0.000 5 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。 进一步培养Raw264.7细胞，PA 200 μmol/L和LPS 10 ng/mL联合处理，12、24 h细胞CD68染色阳性比例较单PA处理组显著增加（P<0.01）；单用PA 200 μmol/L处理24 h时，细胞CD68染色阳性比例较对照组显著增加（P<0.05）；下瘀血汤含药血清（5%）处理组的CD68染色阳性比例显著低于PA+LPS处理组（P值均<0.01）。提示PA处理24 h可诱导Raw264.7细胞向M1极化增多，下瘀血汤可下调PA+LPS处理诱导的CD68染色阳性比例。同时，用ELISA法检测细胞上清液，PA+LPS处理组较单PA处理组TNF-α、IL-6分泌显著增加（P值均<0.01），下瘀血汤含药血清（5%）处理组较PA+LPS处理组TNF-α、IL-6的表达显著下调（P值均<0.05）（图4）。
注：*P<0.05，**P<0.01。图 4 PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后CD68、TNF-α、IL-6的表达变化Figure 4. The expression of CD68， TNF-α and IL-6 in Raw264.7 cells treated with PA， LPS and serum containing Xiayuxue decoction用PA 200 μmol/L处理Raw264.7细胞24 h，PCR结果与免疫印迹结果类似，与对照组比较，PA可诱导炎症因子IL-18、IL-1β和TNF-α的mRNA表达上调，下调NLRP6 mRNA和蛋白的表达，促进p-NF-κB p65 mRNA和蛋白水平显著升高（P值均<0.05），提示PA可诱导Raw264.7细胞活化；与PA处理组比较，下瘀血汤含药血清（5%）处理可抑制炎症因子的表达，上调NLRP6，减轻p-NF-κB p65水平（P值均<0.05），提示下瘀血汤通过上调NLRP6抑制p-NF-κB p65（图5，表7、8）。
图 5 PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后p-NF-κB、NLRP6蛋白表达情况Figure 5. The expression of p-NF-κB and NLRP6 protein in rat Raw264.7 cells treated with PA， LPS and serum containing Xiayuxue decoction表 7 体外实验中炎症因子mRNA相对表达量比较Table 7. Comparison of relative expression levels of inflammatory factor mRNA in vitro组别 IL-1β TNF-α IL-18 NLRP6 对照组 1.00±0.05 1.00±0.15 1.00±0.34 1.00±0.14 PA组 4.87±0.211） 3.55±0.011） 5.57±1.951） 0.63±0.041） PA+XYXD组 2.28±0.392） 2.76±0.532） 2.71±0.112） 1.28±0.292） F值 177.64 51.00 12.16 9.32 P值 0.000 1 0.000 1 0.008 0.014 注：与对照组比较，1）P<0.05；与PA组比较，2）P<0.05。 表 8 体外试验中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析Table 8. Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in vitro组别 p-NF-κB灰度值（%） NLRP6灰度值（%） 对照组 0.31±0.16 54.57±3.44 XYXD组 3.27±0.08 63.25±2.06 PA组 99.13±3.031） 21.42±2.021） PA+XYXD组 32.83±10.832） 53.53±14.682） F值 262.96 19.04 P值 0.000 1 0.005 注：与对照组比较，1）P<0.05；与PA组比较，2）P<0.05。 3. 讨论
NAFLD是中医的优势病种［5］，中医专家共识意见［6］认为肝体用失调、脾肾亏虚为主要特点，痰、湿、瘀、热等为主要病理因素。出自东汉医圣张仲景之《金匮要略·妇人产后病脉证治》的下瘀血汤具有活血化瘀、破瘀散结的功效，与NASH病因病机相合，可能是其治疗NAFLD有效的中医基础。
笔者前期研究［3］已经证明下瘀血汤治疗可有效改善蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型的脂肪变和炎症。本研究构建了HFD小鼠模型，更好地模拟了肥胖、血脂代谢异常和代谢综合征等特征［7］。HE染色可见HFD模型NAS评分显著升高，油红染色可见HFD组脂肪变性特征显著，下瘀血汤治疗可显著下调NAS评分及脂肪变。
NAFLD的特征之一是炎症表型，其涉及免疫细胞易位和激活，以及炎症信号通路的激活和炎性细胞因子的分泌。本研究模型中PCR和免疫组化染色均显示CD68的表达在HFD组中上调，XYXD组下调。可见HFD模型可导致巨噬细胞增加，NASH发展过程中诱导肝巨噬细胞积累活化，加重肝脏损害［8］。下瘀血汤治疗可下调巨噬细胞活化，从而抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子如IL-1β、IL-18、IL-33等，抑制机体启动固有免疫应答［9-10］。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLR）是细胞质蛋白家族，可检测细胞内病原体产物，介导巨噬细胞的免疫进程，是巨噬细胞活化和功能实现的关键蛋白［11］。NLRP6在肝脏中主要表达于巨噬细胞［12］，且NLRP6的缺失可导致肝脏中单核细胞来源的巨噬细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞的数量减少［13］。本研究模型中免疫组化染色证实NLRP6表达于巨噬细胞。NLR最重要的炎症途径之一是炎症小体，炎症小体可介导炎症细胞因子（IL-1β和IL-18）的活化和分泌，以响应细菌LPS等激活信号。NAFLD发展过程中存在炎症小体激活，加重疾病进展，但这些结果主要以NLRP3炎症小体为主，或无法区分不同的炎症小体复合物。本研究结果也显示出NLRP6在HFD组下调，但Caspase-1和ASC并未与NLRP6同样下调。
在巨噬细胞的活化过程中，上游的TLR4触发细胞内信号的转导，激活NF-κB，分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎症因子，这些炎症因子在NASH进展中发挥重要作用。在肠道细菌感染中，NLRP6［14］可抑制NF-κB和细胞外调节蛋白激酶信号通路来负调控炎症通路。本研究中，HFD组肝脏NLRP6蛋白表达下调，伴随p-NF-κB p65及炎症因子上调；下瘀血汤干预后NLRP6表达上调，p-NF-κB p65及炎症因子显著下调。免疫组化NLRP6和CD68提示NLRP6与CD68存在共染，下瘀血汤显著抑制CD68上调和NLRP6下调，增加两者共定位。采用PA（200 μmol/L）处理Raw264.7细胞24 h，发现在24 h时CD68阳性细胞比例较对照组显著增加（P<0.05），联合LPS处理，增加炎症刺激，CD68阳性细胞比例较PA组显著增加（P<0.01）；同时，PA联合LPS处理时，细胞上清液中TNF-α、IL-6表达较PA处理组显著升高（P值均<0.01）。PA可上调p-NF-κB p65，下调NLRP6蛋白表达；下瘀血汤含药血清处理可减轻细胞极化和炎症。提示下瘀血汤可通过抑制NLRP6的下调，下调p-NF-κB p65，抑制巨噬细胞M1极化，减轻NAFLD的炎症。
综上所述，HFD诱导的NAFLD小鼠模型应用下瘀血汤进行干预可有效改善其肝脂肪变和炎症。下瘀血汤可能通过调节NLRP6/NF-κB信号通路减少巨噬细胞活化。
-
图 1 各组小鼠HE染色、油红染色结果
Figure 1. The results of HE staining and oil red staining in each group
注： 黑色箭头表示CD68阳性，红色箭头表示NLRP6阳性。
图 2 各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6表达（免疫组化，×400）
Figure 2. Expression of CD68 and NLRP6 in liver tissue of mice in each group （IHC stain，×400）
注：*P<0.05，**P<0.01。
图 4 PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后CD68、TNF-α、IL-6的表达变化
Figure 4. The expression of CD68， TNF-α and IL-6 in Raw264.7 cells treated with PA， LPS and serum containing Xiayuxue decoction
图 5 PA、LPS和下淤血汤含药血清处理鼠Raw264.7细胞后p-NF-κB、NLRP6蛋白表达情况
Figure 5. The expression of p-NF-κB and NLRP6 protein in rat Raw264.7 cells treated with PA， LPS and serum containing Xiayuxue decoction
表 1 引物序列表
Table 1. Primer sequence table
基因 上游（5′-3′） 下游（5′-3′） 18S GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG TNF-α ATGAGAGGGAGGCCATTTG CAGCCTCTTCTCATTCCTGC IL-1β AGGTCAAAGGTTTGGAAGCA TGAAGCAGCTATGGCAACTG CD68 ACATTGTATTCCACCGCCAT CATCCCCACCTGTCTCTC IL-18 AACCGCAGTAATACGGAGCA CTGGTCTGGGATTCGTTGG NLRP6 CTCGCTTGCTAGTGACTACAC AGTGCAAACAGCGTCTCGTT Caspase-1 ACAAGGCACGGGACCTATG TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG ASC TGAGCAGCTGCAAACGACTA AGGAGGAACAGTTAAGCGCC 
下载: 导出CSV
表 2 各组小鼠血清转氨酶及血脂水平
Table 2. Serum transaminase and blood lipid levels of mice in each group
组别 动物数（只） ALT（U/L） AST（U/L） TC（μmol/L） TG（μmol/L） LFD组 5 7.94±3.15 4.31±2.63 1.19±0.08 0.53±0.19 HFD组 5 85.31±31.991） 52.06±19.451） 1.87±0.341） 2.68±1.291） XYXD组 5 23.17±8.572） 15.36±6.732） 1.34±0.232） 1.14±0.172） F值 22.76 21.77 10.08 10.49 P值 0.000 1 0.000 1 0.003 0.002 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 3 各组小鼠肝脏油红染色半定量及NAS评分比较
Table 3. Semi quantitative oil red staining and NAS score of liver in each group of mice
组别 动物数（只） 油红染色阳性面积（%） NAS评分 LFD组 5 0.83±0.26 1.33±0.21 HFD组 5 34.20±4.871） 5.50±0.431） XYXD组 5 6.27±1.202） 3.17±0.482） F值 34.52 28.72 P值 0.000 1 0.000 1 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 4 各组小鼠肝组织中炎症相关因子mRNA相对表达量比较
Table 4. Comparison of relative expression levels of inflammatory related factor mRNA in liver tissues of mice in each group
组别 IL-1β TNF-α CD68 IL-18 NLRP6 Caspase-1 ASC LFD组 1.00±0.61 0.83±0.45 1.00±0.25 1.00±0.30 1.00±0.24 1.03±0.45 1.00±0.29 HFD组 2.63±0.661） 12.19±8.671） 3.81±2.911） 4.43±3.391） 0.41±0.251） 4.87±0.911） 2.50±1.141） XYXD组 1.56±0.992） 2.77±2.022） 1.56±0.412） 1.80±0.802） 0.76±0.302） 2.36±0.722） 1.43±0.882） F值 11.44 15.74 8.58 8.80 12.62 36.67 8.37 P值 0.000 2 0.000 1 0.001 0.001 0.000 1 <0.000 1 0.001 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 5 各组小鼠肝组织中CD68和NLRP6含量半定量分析
Table 5. Semiquantitative analysis of CD68 and NLRP6 content in liver tissue of mice in each group
组别 CD68阳性面积（%） NLRP6阳性面积（%） LFD组 1.27±0.99 5.22±2.20 HFD组 11.11±3.901） 0.69±0.361） XYXD组 5.56±1.672） 3.84±2.17 F值 11.56 7.98 P值 0.009 0.020 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 6 各组小鼠肝组织中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析
Table 6. Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in liver of mice in each group
组别 p-NF-κB灰度值 NLRP6灰度值 LFD组 4.89±0.86 17.43±2.06 HFD组 23.31±2.441） 4.42±1.201） XYXD组 11.91±0.842） 14.52±2.212） F值 35.16 13.25 P值 0.000 1 0.000 5 注：与LFD组比较，1）P<0.05；与HFD组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 7 体外实验中炎症因子mRNA相对表达量比较
Table 7. Comparison of relative expression levels of inflammatory factor mRNA in vitro
组别 IL-1β TNF-α IL-18 NLRP6 对照组 1.00±0.05 1.00±0.15 1.00±0.34 1.00±0.14 PA组 4.87±0.211） 3.55±0.011） 5.57±1.951） 0.63±0.041） PA+XYXD组 2.28±0.392） 2.76±0.532） 2.71±0.112） 1.28±0.292） F值 177.64 51.00 12.16 9.32 P值 0.000 1 0.000 1 0.008 0.014 注：与对照组比较，1）P<0.05；与PA组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
表 8 体外试验中p-NF-κB和NLRP6含量灰度值半定量分析
Table 8. Semiquantitative analysis of p-NF-κB and NLRP6 content in vitro
组别 p-NF-κB灰度值（%） NLRP6灰度值（%） 对照组 0.31±0.16 54.57±3.44 XYXD组 3.27±0.08 63.25±2.06 PA组 99.13±3.031） 21.42±2.021） PA+XYXD组 32.83±10.832） 53.53±14.682） F值 262.96 19.04 P值 0.000 1 0.005 注：与对照组比较，1）P<0.05；与PA组比较，2）P<0.05。
下载: 导出CSV
-
[1] NATARAJAN Y, KRAMER JR, YU X, et al. Risk of cirrhosis and hepatocellular cancer in patients with NAFLD and normal liver enzymes[J]. Hepatology, 2020, 72( 4): 1242- 1252. DOI: 10.1002/hep.31157. [2] ZHOU F, ZHOU JH, WANG WX, et al. Unexpected rapid increase in the burden of NAFLD in China from 2008 to 2018: A systematic review and meta-analysis[J]. Hepatology, 2019, 70( 4): 1119- 1133. DOI: 10.1002/hep.30702. [3] WU L, ZHANG J, MA WT, et al. Xiayuxue decoction inhibits methionine-choline-deficient-induced nonalcoholic steatohepatitis in mice[J/OL]. Chin J Liver Dis Electron Version, 2018, 10( 3): 48- 55. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2018.03.009.吴柳, 张洁, 马文婷, 等. 下瘀血汤对胆碱蛋氨酸缺乏诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎的抑制作用[J/OL]. 中国肝脏病杂志(电子版), 2018, 10( 3): 48- 55. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7380.2018.03.009. [4] KLEINER DE, BRUNT EM, VAN NATTA M, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease[J]. Hepatology, 2005, 41( 6): 1313- 1321. DOI: 10.1002/hep.20701. [5] SHI XJ, TAN X, ZHANG XS, et al. Discussion on medication rule of non-alcoholic fatty liver disease based on national patent of traditional Chinese medicine compound[J]. Chin Med Herald, 2022, 19( 20): 148- 151, 156.施晓军, 谭祥, 章晓思, 等. 基于国家中药复方专利探讨非酒精性脂肪性肝病的用药规律[J]. 中国医药导报, 2022, 19( 20): 148- 151, 156. [6] Branch of Gastrointestinal Diseases, China Association of Chinese Medicine. Expert consensus on TCM diagnosis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease(2017)[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33( 12): 2270- 2274. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.002.中华中医药学会脾胃病分会. 非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见(2017)[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33( 12): 2270- 2274. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.002. [7] ALSHAWSH MA, ALSALAHI A, ALSHEHADE SA, et al. A comparison of the gene expression profiles of non-alcoholic fatty liver disease between animal models of a high-fat diet and methionine-choline-deficient diet[J]. Molecules, 2022, 27( 3): 858. DOI: 10.3390/molecules27030858. [8] BIJNEN M, JOSEFS T, CUIJPERS I, et al. Adipose tissue macrophages induce hepatic neutrophil recruitment and macrophage accumulation in mice[J]. Gut, 2018, 67( 7): 1317- 1327. DOI: 10.1136/gutjnl-2016-313654. [9] KAZANKOV K, JØRGENSEN SMD, THOMSEN KL, et al. The role of macrophages in nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16( 3): 145- 159. DOI: 10.1038/s41575-018-0082-x. [10] WANG XJ, DE CARVALHO RIBEIRO M, IRACHETA-VELLVE A, et al. Macrophage-specific hypoxia-inducible factor-1α contributes to impaired autophagic flux in nonalcoholic steatohepatitis[J]. Hepatology, 2019, 69( 2): 545- 563. DOI: 10.1002/hep.30215. [11] HENAO-MEJIA J, ELINAV E, JIN CC, et al. Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity[J]. Nature, 2012, 482( 7384): 179- 185. DOI: 10.1038/nature10809. [12] CORRIDONI D, SIMMONS A. Innate immune receptors for cross-presentation: The expanding role of NLRs[J]. Mol Immunol, 2019, 113: 6- 10. DOI: 10.1016/j.molimm.2017.11.028. [13] MAINZ RE, ALBERS S, HAQUE M, et al. NLRP6 inflammasome modulates disease progression in a chronic-plus-binge mouse model of alcoholic liver disease[J]. Cells, 2022, 11( 2): 182. DOI: 10.3390/cells11020182. [14] LI MF, CHEN YT, SHI JR, et al. NLRP6 deficiency aggravates liver injury after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 74: 105740. DOI: 10.1016/j.intimp.2019.105740. 期刊类型引用(3)
1. 卢毅，赵园，龙思琴，刘清秀，潘凌云，吕娇健. 6E-UDCA通过FABP7信号通路对MAFLD小鼠脂质代谢的影响研究. 浙江医学. 2024(21): 2288-2291 . 
百度学术2. 赵鑫，王知意，陶乐，杨广越，张玮，吴柳，马文婷，陈蒨，刘旭凌，刘成. 下瘀血汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肾损伤的干预作用及其机制. 临床肝胆病杂志. 2024(11): 2213-2220 . 
本站查看3. 胡莉，王雅，张涛，郭丹，银思涵. 超微脂康饮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠M1/M2型巨噬细胞极化的影响. 时珍国医国药. 2024(15): 3327-3332 . 百度学术其他类型引用(0)
-
下载:
百度学术
