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Effect of human liver-derived stem cells in prevention and treatment of alcoholic fatty liver disease in mice
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摘要:
目的探讨人肝源性干细胞腹腔移植对小鼠酒精性脂肪肝的防治作用。方法将30只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组（N组）、模型对照组（M组）以及肝干细胞移植组（S组）。N组以基础饲料喂养,M组和S组以Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养,S组每周进行2次腹腔肝干细胞移植。干预6周后,测定各组小鼠体质量、肝脏指数,检测血清ALT、AST、TBil、TC、TG、HDL-C、LDL-C,检测肝脏中TG和游离脂肪酸（NEFA）水平,并做肝脏病理学检查和肝组织油红O染色。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 3组间比较,小鼠血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C水平和肝组织TG、NEFA水平差异均具有统计学意义（F值分别为66. 94、7. 15、8. 02、18. 64、3. 86、23. 14、30. 49,P值均<0. 05）。与N组对比,M组小鼠的血清中ALT、AST、TG和肝组织中TG、NEFA明显升高,差异均有统计学意义（P值均<0. 05）。S组小鼠的血清ALT、AST、TG和肝组织TG、NEFA都明显低于M组,差异均...
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关键词:
- 脂肪肝,酒精性 /
- 干细胞移植 /
- 小鼠,近交C57BL
Abstract:Objective To investigate the effect of intraperitoneal transplantation of human liver-derived stem cells in the prevention and treatment of alcoholic fatty liver disease in mice. Methods A total of 30 male C57 BL/6 mice were randomly divided into blank control group ( group N) , model control group ( group M) , and stem cell transplantation group ( group S) . The mice in group N were fed a normal diet, and those in the other two groups were fed Lieber-DeCarli alcohol liquid diet; at the same time, the mice in group S were given intraperitoneal transplantation of human liver-derived stem cells twice a week. After six weeks of intervention, body weight and liver index were measured, and the serum levels of alanine aminotransferase ( ALT) , aspartate aminotransferase ( AST) , total bilirubin ( TBil) , total cholesterol ( TC) , triglyceride ( TG) , high-density lipoprotein cholesterol ( HDL-C) , and low-density lipoprotein cholesterol ( LDL-C) were also measured. The levels of TG and non-esterified fatty acid ( NEFA) in the liver were measured, and liver pathological examination and oil red O staining of the liver were performed. One-way ANOVA was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-q test was used for further comparison between two groups. Results There were significant differences in the serum levels of ALT, AST, TG, TC, and HDL-C and the content of TG and NEFA in the liver between the three groups ( F = 66. 94, 7. 15, 8. 02, 18. 64, 3. 86, 23. 14 and 30. 49, all P < 0. 05) , Compared with group N, group M showed significant increases in levels of ALT, AST, and TG in serum and levels of TG and NEFA in liver tissue ( all P < 0. 05) . Group S had significantly lower levels of ALT, AST, and TG in serum and levels of TG and NEFA in liver tissue than group M ( all P < 0. 05) . Liver HE staining and oil red O staining showed that group S had a significantly lower degree of liver steatosis than group M. Conclusion Intraperitoneal transplantation of human liver-derived stem cells has a marked effect in the prevention and treatment of alcoholic fatty liver disease in mice.
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Key words:
- fatty liver, alcoholic /
- stem cell transplantation /
- mice, inbred C57BL
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慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝炎或肝硬化基础上出现急性肝功能失代偿。临床工作中发现，随着急性肝损伤的减轻和时间的推移，部分非肝硬化基础上ACLF患者肝功能逐渐恢复，但部分患者会逐渐出现非可逆性肝硬化。以往学者更多关注ACLF的短期存活率[1-3]，临床实际中，存活的ACLF恢复期患者预后同样值得关注，本研究通过动态观察非肝硬化基础上ACLF恢复期患者的临床及影像学检查结果，初步探索了影响非肝硬化基础上ACLF恢复期患者在48周发生肝硬化的危险因素，有望为指导ACLF恢复期患者的随访管理提供依据。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取2015年1月—2019年6月于首都医科大学附属北京佑安医院疑难肝病及人工肝科收治的ACLF患者，以首次诊断ACLF的时间为基线，所有患者入院后均接受标准化治疗，通过查阅电子病历及电话随访获取患者的预后情况。纳入标准：(1)符合亚太肝病学会(APASL)发布的ACLF诊断标准[2]，在慢性肝病基础上出现急性肝损伤症候群，表现为4周内出现黄疸(TBil≥85 μmol/L)，凝血异常(INR≥1.5)，伴随腹水和/或肝性脑病；(2)随访时间大于48周且临床资料齐全。排除标准：(1)肝硬化基础上的ACLF患者；(2)随访期间行肝移植术者；(3)临床病例资料缺失者；(4)拒绝随访或电话信息缺失者。根据纳入和排除标准，最终纳入了57例非肝硬化基础上ACLF患者。根据48周有无发生肝硬化分为非肝硬化组和肝硬化组。
ACLF恢复参考APASL-ACLF专家共识[2]：乏力及消化道症状基本消失，TBil下降至≤85 μmol/L，INR＜1.5，无肝性脑病及明显腹水。
1.2 研究方法
收集患者的性别、年龄、肝病基础、并发症、入院时各项相关临床指标、影像学检查(CT或MRI)结果等，并记录患者随访期间的临床相关数据。根据提取的临床数据和资料，计算患者基线MELD和MELD-Na评分以及无创肝纤维化评分Sheth、AST和PLT比值指数(APRI)和肝纤维化4因子(FIB-4)指数。Sheth指数=AST /ALT；APRI指数=(AST/正常值上限×100)/PLT；FIB-4指数=(年龄×AST)/(PLT ×ALT1/2)。通过临床及影像学检查判断基线、距离基线4周和48周时患者是否发生肝硬化情况。肝硬化影像学显示肝脏形态不规则，边缘呈波浪状，肝叶比例失调，部分肝节段明显萎缩，肝裂显著增宽且不规则[4]。
1.3 伦理学审查
本研究方案经由首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会审批，批号：LL-2020-178-K。
1.4 统计学方法
采用R软件(版本号R×64 4.0.3)对数据进行统计分析，正态分布计量资料以x ±s表示，两组间比较采用t检验，非正态分布计量资料以M(P25~P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。将组间比较P＜0.05的因素纳入logistic单因素及多因素分析，并通过经受试者工作特征曲线(ROC曲线)评估独立危险因素的预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
57例非肝硬化基础上ACLF患者中男性居多，为49例(85.9%)；慢性肝病病因有慢性乙型肝炎44例、酒精性肝病6例、慢性乙型肝炎合并酒精性肝病3例、药物性肝病2例、慢性乙型肝炎合并非酒精性脂肪肝1例，不明原因肝病1例。
在57例恢复期患者中，经动态观察发现，有26例患者在随访4周内有肝硬化表现，其中9例(34.6%)患者在随访48周时发现肝硬化消失；17例患者持续肝硬化状态，具体的动态过程详见图 1，最终在48周进展至肝硬化的患者有26例(45.6%)。
2.2 两组一般资料、实验室指标、肝纤维化及肝衰竭预后评分比较
肝硬化组中ChE和PLT均显著低于非肝硬化组，差异均具有统计学意义(P值均＜0.05)；两项肝衰竭预后评分及三项无创肝纤维化评分比较，肝硬化组FIB-4指数显著高于非肝硬化组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。年龄、性别、肝衰竭并发症方面在两组患者中的分布差异均无统计学意义，两组患者的ALT、AST、ALP、GGT、Alb、TBil、INR、Cr、Na、AFP、Hb、WBC水平差异均无统计学意义(P值均＞0.05)(表 1)。
表 1 两组一般资料、实验室指标及相关评分比较项目 非肝硬化组(n=31) 肝硬化组(n=26) 统计值 P值 男[例(%)] 27(87.1) 22(84.6) 1.000 年龄(岁) 39.61±10.65 43.50±10.60 t=-1.376 0.175 并发症[例(%)] 自发性腹膜炎 29(93.5) 23(88.5) 0.651 腹水 17(54.8) 19(73.1) χ2=1.314 0.252 肝性脑病 5(16.1) 1(3.8) 0.205 急性肾损伤 3(9.7) 2(7.7) 1.000 上消化道出血 1(3.2) 0 1.000 ALT(U/L) 388.05(140.70~1330.53) 189.60(81.72~507.97) Z=497.0 0.080 AST(U/L) 250.45(118.35~592.58) 197.40(98.92~406.53) Z=450.5 0.324 ALP(U/L) 141.00(106.80~164.20) 138.30(120.00~160.70) Z=197.5 0.968 GGT(U/L) 123.90(80.10~152.50) 79.30(56.00~146.70) Z=306.0 0.207 Alb(g/L) 31.71±4.73 30.58±4.38 t=0.921 0.361 TBil(μmol/L) 288.74±137.39 319.45±132.47 t=-0.857 0.395 ChE(U/L) 4137.59±1604.83 2844.32±961.05 t=3.177 0.003 INR 2.21 (1.90~2.84) 2.12 (1.73~2.45) Z=474.0 0.259 Cr(μmol/L) 56.10(47.80~66.50) 63.50(52.25~71.75) Z=344.5 0.353 Na(mmol/L) 136.95±4.17 136.15±3.27 t=0.818 0.417 AFP(ng/ml) 86.42(32.79~185.45) 88.67(17.68~177.42) Z=353.0 0.435 Hb(g/L) 133.00±19.50 123.50±20.85 t=1.752 0.086 WBC(×109/L) 7.20(5.35~8.86) 6.44(4.90~9.30) Z=446.0 0.496 PLT(×109/L) 138.84±56.46 100.04±57.28 t=2.564 0.013 肝纤维化评分 Sheth指数 0.65(0.49~1.05) 1.07(0.55~1.55) Z=295.0 0.121 APRI指数 6.35(2.25~10.42) 4.93(2.96~9.04) Z=365.0 0.690 FIB-4指数 4.45(2.14~7.80) 7.81(3.92~11.36) Z=258.0 0.030 肝衰竭预后评分 MELD-Na评分 21.33±3.75 20.49±4.42 t=0.754 0.455 MELD评分 18.04(13.48~22.00) 16.67(14.16~22.76) Z=370.0 0.781 2.3 非肝硬化基础上ACLF恢复期患者48周发生肝硬化的单因素和多因素logistic回归分析
将组间比较结果中具有统计学差异的指标纳入logistic回归分析，结果显示低水平的ChE和PLT是非肝硬化基础上ACLF恢复期患者发生肝硬化的独立危险因素(P值均＜0.05)(表 2)。
表 2 预测非肝硬化基础上ACLF恢复期患者48周发生肝硬化的单因素和多因素分析变量 单因素分析 多因素分析 OR(95%CI) P值 OR(95%CI) P值 ChE 1.001(1.000~1.002) 0.011 1.001(1.000~1.002) 0.010 PLT 1.013(1.002~1.024) 0.020 1.015(1.002~1.028) 0.027 FIB-4指数 0.933(0.847~1.027) 0.156 2.4 ChE和PLT对非肝硬化基础上ACLF恢复期患者48周发生肝硬化的预测效能
经ROC曲线分析结果显示，ChE预测非肝硬化基础上ACLF患者48周发生肝硬化的曲线下面积(AUC)为0.761(95%CI: 0.613~0.908) (P=0.004)；PLT预测的AUC为0.702(95%CI: 0.538~0.866)(P=0.027)；两项指标联合预测的AUC为0.835(95%CI: 0.713~0.957)(P＜0.001)，提示两项指标联合在肝硬化的预测方面具有更大的效能(图 2)。
3. 讨论
ACLF疾病发生发展过程中存在肝细胞大量坏死，在疾病恢复过程中，会发现部分原本无肝硬化基础的患者会逐渐出现肝硬化情况，其发生率尚不明确，缺乏简单而准确的指标或评分来提前识别这些患者，也缺乏规范实用的ACLF恢复期管理方案。
本研究发现57例非肝硬化基础上ACLF患者中随访至48周有26例(45.6%)患者发生肝炎坏死后肝硬化，这与国内一项研究[5]结果相似，研究者对65例CHB基础上ACLF随访3个月，发现有30例(46%)患者发生肝炎坏死后肝硬化。这提示有近50%的非肝硬化基础上ACLF患者在1年内进展为肝硬化，关注这一类患者的预警危险因素对临床指导至关重要。本研究发现，57例患者中有9例在随访4周内发生肝硬化，但随访48周肝硬化消失，提示在肝衰竭疾病早期，部分患者因严重肝损伤，其影像学可能表现为肝硬化征象，而通过恢复期的肝脏修复，这种肝硬化是可逆的。有学者[6]通过分析乙型肝炎相关ACLF患者的CT表现发现，47.4%的ACLF患者肝脏体积缩小，以中晚期患者为主，病程超过数周肝内可形成结节样再生，因此肝衰竭患者在病程不同时期表现为不同的CT特征性表现。在患者恢复的过程中如残留肝细胞增生、肝脏再生能力较强的情况下，肝脏生化指标恢复的同时，肝脏影像学也会改善[7]。另外，有9例在随访4周内没有出现肝硬化，但随访48周发生肝硬化。部分患者虽然在疾病早期没有表现为肝硬化，但因肝损伤严重，在修复过程中逐渐出现了肝硬化。由于患者入院时往往处于ACLF病程不同阶段，因此表现出不同影像学特征，故在肝衰竭疾病早期评估有无肝硬化尚不准确，据此笔者将评估终点定在距离基线48周。通过对多项指标的单因素及多因素分析，发现ChE和PLT是非肝硬化基础上ACLF恢复期患者48周时发生肝硬化的独立危险因素，两者联合预测更有优势。
肝脏是合成血清ChE的唯一场所，ChE受肝脏合成和分解代谢的影响。在急性病毒性肝炎、慢性活动性肝炎、失代偿期肝硬化以及肝衰竭等肝脏疾病中均可检测到不同程度ChE的降低。因此血清ChE是一个评估肝脏储备功能极为敏感、稳定的指标，不仅反映肝脏的合成功能，且反映肝组织损伤的程度，是判断慢性肝病转归的良好指标[8]。ChE与MELD评分联合应用，可减少肝外因素造成的MELD评分误差，提高其对肝脏储备功能评价的精准度，对肝病患者的预后判断具有重要价值[9]。GGT-PLT比值(GPR)可用于预测慢性乙型肝炎(CHB)的明显纤维化和肝硬化方面，近期国内一项大型队列研究[10]证实，GPR指数在增加ChE参数后，具有更高的评估性能。此外，有研究者[11]开发了融合游离四碘甲状腺素、PLT、ChE、GGT和年龄等参数的FibroStage评分方法，证实与APRI、FIB-4、Lok等指数比较，FibroStage可更好地用于全面诊断显著肝纤维化、晚期肝纤维化和肝硬化。由于ChE不易受黄疸、输血制品等其他因素影响，稳定性好，未来可作为预测肝脏疾病进展和预后的重要指标之一。
PLT具有在内皮破裂或血管损伤时介导止血的作用外，还是与肝损伤程度、纤维化阶段及疾病预后密切相关的参数[12]。肝修复和再生需要促增殖和抗增殖信号来协调组织修复，研究[13-14]显示PLT在对肝细胞产生促有丝分裂作用的同时，可抑制纤维化形成并启动纤维溶解途径。诱导慢性胆汁淤积小鼠PLT减少会导致肝纤维化，从而使肝功能恶化[15-16]。人类PLT可通过分泌肝细胞生长因子抑制严重联合免疫缺陷小鼠的肝纤维化，HGF通过同时阻止肝星状细胞激活和促进基质金属蛋白酶9的表达来发挥抗纤维化作用[17-18]。
PLT是众多肝脏疾病评分中的重要参数之一，如肝纤维化评分：APRI[19]、FIB-4[20]、GPR[21]、FibroStage[11]、红细胞体积分布宽度-血小板比值[22]、球蛋白-血小板模型[23]、肝脏硬度测定值(LSM)与PLT比值[24]，以及以PLT和LSM为基础的Baveno Ⅵ标准(B6C)[25]等，充分提示PLT在肝脏疾病评估和预测中的重要性，其地位不容小觑。
综上，目前越来越多研究证实ChE和PLT参数在预测肝纤维化、肝损伤程度和疾病预后方面具有重要地位。本研究也表明ChE和PLT在预测非肝硬化基础上ACLF恢复期患者48周时发生肝硬化具有一定效能，是两项独立危险因素。这两项指标检测费用低廉、且易于应用，作为非肝硬化基础ACLF恢复期患者发生肝硬化的预测指标，对此类患者个性化治疗及复诊建议有较好的指导价值。甚至对以后ACLF恢复期患者规范的随访管理流程制订有一定参考价值。
因相关临床资料完整的病例较为稀缺，本研究具有一定的局限性，是小样本、单中心、包含不同病因非肝硬化基础ACLF患者的回顾性研究，可能存在混杂因素影响统计分析结果，若想获得能够更为准确的预测指标或模型，尚需要大样本、多中心、针对不同病因的前瞻性研究加以验证及进一步探索。
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[1] Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Study Group of the Chi-nese Liver Disease Association, Chinese Medical Association.Guidelines for prevention and treatment of alcoholic liver dis-ease (revised version 2010) [J]. J Clin Hepatol, 2010, 26 (3) :229-232. (in Chinese) 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南 (2010年修订版) [J].临床肝胆病杂志, 2010, 26 (3) :229-232. [2] European Association for the Study of Liver. EASL clinical practi-cal guidelines:Management of alcoholic liver disease[J]. J Hep-atol, 2012, 57 (2) :399-420. [3] WARREN KR, MURRAY MM. Alcoholic liver disease and pan-creatitis:Global health problems being addressed by the USNational Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism[J]. J Gas-troenterol Hepatol, 2013, 28 (Suppl 1) :4-6. [4] O'SHEA RS, DASARATHY S, MCCULLOUGH AJ. Alcoholicliver disease[J]. Hepatology, 2010, 51 (1) :307-328. [5] MCCULLOUGH AJ, O'SHEA RS, DASARATHY S. Diagnosisand management of alcoholic liver disease[J]. J Dig Dis, 2011, 12 (4) :257-262. [6] FAN JG. Epidemiology of alcoholic and nonalcoholic fatty liverdisease in China[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28 (Sup-pl 1) :11-17. [7] AKIYAMA K, CHEN C, WANG D, et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis[J]. Cell Stem Cell, 2012, 10 (5) :544-555. [8] KUO TK, HUNG SP, CHUANG CH, et al. Stem cell therapyfor liver disease:Parameters governing the success of usingbone marrow mesenchymal stem cells[J]. Gastroenterology, 2008, 134 (7) :2111-2121. [9] ZHANG Z, WANG FS. Stem cell therapies for liver failure andcirrhosis[J]. J Hepatol, 2013, 59 (1) :183-185. [10] SPAHR L, LAMBERT JF, RUBBIA-BRANDT L, et al. Granu-locyte-colony stimulating factor induces proliferation of hepat-ic progenitors in alcoholic steatohepatitis:A randomized trial[J]. Hepatology, 2008, 48 (1) :221-229 [11] AURICH H, SGODDA M, KALTWASSER P, et al. Hepatocytedifferentiation of mesenchymal stem cells from human adiposetissue in vitro promotes hepatic integration in vivo[J]. Gut, 2009, 58 (4) :570-581. [12] BI YZ, FAN Z, CHEN DF, et al. Protective effect of intraperito-neal transplantation of human fiver-derived stem cells at dif-ferent times against concanavalin A-induced acute liver injuryin mice[J]. Chin J Hepatol, 2017, 25 (3) :205-210. (inChinese) 毕研贞, 樊增, 陈东风, 等.人肝源性干细胞腹腔移植不同时间对Con A诱导小鼠急性肝损伤保护作用[J].中华肝脏病杂志, 2017, 25 (3) :205-210. [13] LOMBARD R, BUZZETTI E, ROCCARINA D, et al. Non-in-vasive assessment of liver fibrosis in patients with alcoholic liv-er disease[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21 (39) :11044-11052. [14] MANDAL A, GRUPP A, SCHWEDERSKI B, et al. Noninno-cently behaving bridging anions of the widely distributed an-tioxidant ellagic acid in diruthenium complexes[J]. InorgChem, 2015, 54 (20) :10049-10057. [15] LIN XX, CHEN D, ZHAO Q, et al. Genetic research on the in-cidence of alcoholic liver disease[J]. Chin J Clin PharmacolTher, 2017, 22 (11) :1309-1314. (in Chinese) 林秀贤, 陈丹, 赵青, 等.影响酒精性肝病发病的遗传学研究进展[J].中国临床药理学与治疗学, 2017, 22 (11) :1309-1314. [16] SZABO G. Gut-liver axis in alcoholic liver disease[J]. Gas-troenterology, 2015, 148 (1) :30-36. [17] DI CAMPLI C, PISCAGLI AC, PIERELLI L, et al. A human um-bilical cord stem cell rescue therapy in a murine model of toxicliver injury[J]. Dig Liver Dis, 2004, 36 (9) :603-613. [18] YANG S, KOTEISH A, LIN H, et al. Oval cells compensate fordamage and replicative senescence of mature hepatocytes inmice with fatty liver disease[J]. Hepatology, 2004, 39 (2) :403-411. [19] MARGINI C, VUKOTIC R, BRODOSI L, et al. Bone marrowderived stem cells for the treatment of end-stage liver dis-ease[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (27) :9098-9105. [20] CHEN Q, KHOURY M, LIMMON G, et al. Human fetal hepaticprogenitor cells are distinct from, but closely related to, hema-topoietic stem/progenitor cells[J]. Stem Cells, 2013, 31 (6) :1160-1169. [21] PICHARD V, FERRY N. Origin of small hepatocyte-like pro-genitor in retrorsine-treated rats[J]. J Hepatol, 2008, 48 (2) :368-369. [22] GERBAL-CHALOIN S, FUNAKOSHI N, CAILLAUD A, et al.Human induced pluripotent stem cells in hepatology:Beyondthe proof of concept[J]. Am J Pathol, 2014, 184 (2) :332-347. [23] ENOSAWA S, HORIKAWA R, YAMAMOTO A, et al. Hepato-cyte transplantation using a living donor reduced graft in a ba-by with ornithine transcarbamylase deficiency:A novel sourceof hepatocytes[J]. Liver Tranpl, 2014, 20 (3) :391-393. -
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