慢性乙型肝炎(CHB)是由HBV持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。全世界约有2.57亿人感染HBV^[1]，我国HBV感染者高达普通人群的10%^[2]，而CHB患者约有3000万人^[3]。因此，CHB仍是我国乃至全球肝脏疾病相关死亡率的主要原因。抗病毒治疗是CHB的核心治疗，核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒效果强、服用方便且不良反应少，在临床上被广泛应用，但因其不能直接作用于肝细胞核内的共价闭合环状DNA(cccDNA)，导致HBV感染难以完全治愈。随着HBV DNA检测灵敏度不断的提高，许多既往认为获得持续病毒学应答(SVR)的患者经高敏HBV DNA检测后发现血清HBV DNA呈低水平复制，即低病毒血症(low-level viremia，LLV)。现有的研究^[4-7]发现，LLV可引起耐药、病毒学突破，甚至与肝纤维化、肝硬化以及肝癌的发生发展相关。目前关于LLV预测模型及HBV血清学标志物的动态变化研究较少。本研究旨在通过回顾性分析NAs初治的CHB患者的临床资料，明确LLV发生的影响因素以及治疗期间患者的血清病毒学指标动态变化。

1.   资料与方法

1.1   研究对象

回顾性分析2020年11月—2022年3月在南昌大学第一附属医院感染科门诊就诊的CHB患者。纳入标准：所有CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》^[8]；接受一线NAs抗病毒治疗至少12个月；基线HBV DNA≥2000 IU/mL。排除标准：同时合并其他类型肝炎病毒、HIV、EB病毒等；合并自身免疫性疾病、恶性肿瘤、严重基础疾病等；至2022年3月，HBV DNA≥2000 IU/mL的患者；依从性差的患者；HBV耐药突变的患者；基线资料或动态资料不全的患者。

1.2   研究方法

根据CHB患者治疗期间的HBV DNA水平，将患者分为SVR组和LLV组。SVR组的定义是在达到了完全病毒学应答后，HBV DNA持续检测不到(＜20 IU/mL)；LLV组的定义为接受一线抗病毒药物治疗至少48周，患者血清HBV DNA持续性或间歇性可检测到(≥20 IU/mL，但＜2000 IU/mL)^[9]。

1.3   观察指标

收集患者的一般资料，包括性别、年龄、BMI、家族史、有无肝硬化、有无代谢相关性脂肪性肝病(MAFLD)；NAs类型包括恩替卡韦(ETV)、富马酸替诺福韦(TDF)和富马酸丙酚替诺福韦(TAF)；实验室指标：基线及12、24、36及48周HBV DNA、HBsAg定量等HBV血清学标志物、肝肾功能、血常规；影像学指标：腹部彩超、LSM等。高敏HBV DNA定量检测采用TaqMan实时荧光定量PCR(仪器：美国罗氏480实时荧光定量PCR仪)，检测下限为20 IU/mL。血清HBV标志物采用的是美国雅培公司Abbott ARCHITECT仪器及试剂分析。血常规、血生化等指标均在南昌大学第一附属医院检验科完成。

1.4   统计学方法

采用SPSS 26.0和MedCalc 20.0软件进行数据统计处理，Graphpad Prism 8.0软件进行绘图。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料用M(P₂₅~P₇₅)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料两组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验。多因素二元Logistic回归分析CHB患者发生LLV的独立影响因素，并建立预测模型，采用Hosmer-Lemeshow检验评估模型的拟合度，运用受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)评估相关因素及模型对CHB患者发生LLV的预测价值。采用Kaplan-Meier分析HBV DNA累积阴转率，应用Log-rank检验进行比较。采用重复测量资料方差分析比较两组间或组内0、12、24、36、48周HBV DNA和HBsAg水平及其变化的差异。HBV DNA及HBsAg定量进行lg转化。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   一般资料

本研究共纳入CHB患者78例，SVR组58例(74.4%)，LLV组20例(25.6%)。患者多为男性(69.2%)，年龄29~39岁，中位年龄32岁。LLV组HBeAg阳性率、HBV DNA、HBsAg水平高于SVR组，年龄、ALT、AST、LSM低于SVR组，差异均具有统计学意义(P值均＜0.05)(表 1)。

表  1  CHB患者基线临床特征和实验室指标分析

Table  1.  Analysis of baseline clinical characteristics and laboratory indexes of CHB patients

项目	所有患者(n=78)	SVR组(n=58)	LLV组(n=20)	统计值	P值
年龄(岁)	32(29~39)	33(30~43)	29(26~34)	Z=-2.751	0.009
男性[例(%)]	54(69.2)	40(68.9)	14(70.0)	χ2=0.007	0.931
家族史[例(%)]	22(28.2)	16(27.6)	6(30.0)	χ2=0.043	0.836
BMI(kg/m2)	23.3±3.7	23.7±4.0	22.3±2.5	t=1.359	0.164
HBeAg阳性[例(%)]	46(59.0)	28(48.3)	18(90.0)	χ2=10.701	0.001
lgHBV DNA(IU/mL)	6.07±1.78	5.65±1.70	7.26±1.46	t=-4.178	＜0.001
lgHBsAg(IU/mL)	3.72±1.02	3.44±0.93	4.53±0.86	t=-4.813	＜0.001
抗-HBc	8.50(7.51~9.83)	8.56(7.65~9.80)	8.46(6.91~9.87)	Z=-0.092	0.927
AST(U/L)	68.0(38.5~125.5)	77.5(35.0~213.0)	43.5(32.8~62.8)	Z=-2.466	0.014
ALT(U/L)	105.0(53.4~218.0)	111.0(47.0~406.0)	67.0(54.0~122.0)	Z=-2.203	0.028
TBil(μmol/L)	15.6(10.2~32.5)	17.0(11.2~36.6)	15.0(9.3~20.7)	Z=-1.087	0.277
Alb(g/L)	44.5(40.2~46.9)	43.6(38.4~46.5)	46.3(42.7~48.5)	Z=2.352	0.073
TG(mmol/L)	1.00(0.63~1.44)	1.03(0.62~1.57)	0.96(0.76~13.20)	Z=-0.069	0.945
Cr(μmol/L)	65.6(56.7~76.4)	62.3(54.9~73.5)	68.2(56.1~71.9)	Z=2.432	0.065
PLT(×109)	181.7±65.9	174.3±67.3	202.7±58.4	t=-1.769	0.067
LSM(kPa)	8.1(6.8~11.2)	8.9(7.2~11.4)	7.7(6.3~8.5)	Z=-2.022	0.043
肝硬化[例(%)]	25(32.1)	20(34.5)	5(25.0)	χ2=0.614	0.433
抗病毒药物类型[例(%)]				χ2=1.345	0.246
ETV初治	66(84.6)	49(84.5)	17(85.0)
TDF或TAF初治	12(15.4)	9(15.5)	3(15.0)
MAFLD[例(%)]	17(21.8)	13(22.4)	4(20.0)	χ2=0.051	0.822

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2.2   CHB患者发生LLV多因素分析及预测模型建立

将单因素分析(表 1)中差异具有统计学意义的指标纳入多因素Logistic回归分析，使用BOX-Tidwell方法检验自变量与因变量的logit转换值之间是否存在线性关系，运用容忍度、方差膨胀因子检验自变量之间的多重共线性，结果显示容差值均0.1~1.0，VIF值均＜10，表明所纳入的自变量之间不存在共线性。多因素Logistic回归分析结果显示，基线HBV DNA(OR=2.365，95%CI: 1.220~4.587，P=0.011)、基线HBsAg(OR=4.229，95%CI: 1.098~16.287，P=0.036)是影响CHB患者发生LLV的独立危险因素，而ALT(OR=0.965，95%CI: 0.937~0.994，P=0.018)是独立保护性因素。根据多因素分析结果，将HBV DNA、HBsAg和ALT再次行二元Logistics回归分析，根据回归系数作为危险因素的权重(表 2)，建立CHB患者发生LLV的预测模型(MLLV)，计算公式为：Logit(MLLV)=-8.668+1.441×lgHBsAg+0.598×lgHBV DNA-0.016×ALT，LLV发生概率P=e^logit(MLLV)/(1+ e^logit(MLLV))。回归模型系数的综合检验结果显示P＜0.001，采用Hosmer-Lemeshow检验，结果显示χ²=11.625，P=0.169，表明模型与观察值拟合度较好(图 1)。

表  2  MLLV模型的建立

Table  2.  Establishment of the MLLV model

变量	B值	SE	Wald	OR	95%CI	P值
lgHBV DNA	0.589	0.245	5.932	1.818	1.124~2.942	0.015
lgHBsAg	1.441	0.586	6.051	4.225	1.340~13.316	0.014
ALT	-0.016	0.007	4.918	0.984	0.969~0.998	0.027
常数	-8.668	2.355	13.551	0.001		＜0.001

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图  1  Logistic回归模型的校准度

Figure  1.  Calibration curve of logistic regression model

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2.3   MLLV模型预测价值的分析

通过绘制HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲线，分析各指标和模型的预测价值(表 3，图 2)。结果显示，MLLV模型预测CHB患者发生LLV的AUC值明显大于HBV DNA、HBsAg、ATL单独预测的AUC值。MLLV模型的最佳截断值为0.44，对应的敏感度为85.00%，特异度为93.10%，AUC值为0.931，95%CI为0.850~0.976，提示该模型具有较好的预测效能(P＜0.001)。

表  3  HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV对LLV发生的预测价值

Table  3.  Predictive value of HBV DNA, HBsAg, ALT and MLLV for the occurrence of LLV

指标	AUC	95%CI	截断值	敏感度	特异度	P值
HBV DNA	0.774	0.665~0.861	7.29	70.00%	82.76%	＜0.001
HBsAg	0.856	0.758~0.925	4.38	85.00%	87.93%	＜0.001
ALT	0.666	0.550~0.769	139.80	95.00%	44.83%	0.007
MLLV	0.931	0.850~0.976	0.44	85.00%	93.10%	＜0.001

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图  2  HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲线

Figure  2.  ROC curve of HBV DNA, HBsAg, ALT and MLLV models

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2.4   不同基线HBV DNA和HBsAg的CHB患者DNA累积阴转率

根据基线HBV DNA的截断值(表 3)将患者分为HBV DNA＞7.29 lgIU/mL组和HBV DNA≤7.29 lgIU/mL组，进一步使用二元Logistic回归分析，结果提示基线HBV DNA＞7.29 lgIU/mL的患者LLV的发生风险是基线HBV DNA≤7.29 lgIU/mL患者的8.944倍(P＜0.001)；同样对根据HBsAg截断值分组的患者进行分析，发现HBsAg＞4.38 lgIU/mL患者LLV的发生风险是HBsAg≤4.38 lgIU/mL患者的35.417倍(P＜0.001)。进一步使用Kaplan-Meier曲线分析不同基线HBV DNA的CHB患者的HBV DNA累积阴转率，发现随着治疗时间的延长，两组患者HBV DNA的阴转率逐渐提高，但基线HBV DNA＜7.29 lgIU/mL组患者HBV DNA阴转率始终高于另一组(χ²=22.52，P＜0.001)(图 3a)；同样使用Kaplan-Meier曲线分析不同基线HBsAg的CHB患者HBV DNA的累积阴转率，结果显示，基线HBsAg≤4.38 lgIU/mL组患者HBV DNA阴转率始终高于另一组(χ²=26.35，P＜0.001)(图 3b)。

图  3  不同基线HBV DNA和HBsAg的CHB患者HBV DNA累积转阴率

注：a，不同HBV DNA水平患者；b，不同HBsAg水平患者。

Figure  3.  Cumulative negative rate of HBV DNA in CHB patients with different baseline HBV DNA and HBsAg

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2.5   治疗期间HBV DNA、HBsAg动态变化分析

CHB患者治疗期间HBV DNA、HBsAg水平均逐渐下降(图 4)，呈先快后慢的趋势，HBV DNA在第12周下降幅度最大[(3.07±1.39)lgIU/mL]，在治疗12周后下降幅度逐渐减小(图 5a)，而HBsAg在第24周下降幅度最大[(0.77±0.32)lgIU/mL](图 5b)。

图  4  两组患者HBV DNA和HBsAg水平变化

注：a，期间HBV DNA的比较；b，治疗期间HBsAg的比较。*P＜0.05。

Figure  4.  Dynamic changes of HBV DNA and HBsAg in two groups

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图  5  所有患者HBV DNA和HBsAg下降幅度变化

注：a，治疗期间HBV DNA下降幅度变化；b，治疗期间HBsAg下降幅度变化。

Figure  5.  The decrease range changes of HBV DNA and HBsAg

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LLV组和SVR组患者随着治疗时间的延长，HBV DNA和HBsAg水平均持续下降，组内比较差异均具有统计学意义(P值均＜0.05)(表 4)，且LLV组患者在治疗基线、12周、24周、36周、48周时的HBV DNA和HBsAg水平始终高于SVR组(P值均＜0.05)。LLV组在第12周和第24周时的HBV DNA下降幅度分别为(3.27±1.07)lgIU/mL、(4.41±1.36)lgIU/mL，而SVR组第12周和第24周时的HBV DNA下降幅度分别为(3.01±1.49)lgIU/mL、(3.80± 1.49)lgIU/mL，差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。对两组在第12周和第24周的HBsAg下降幅度进行分析，发现差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。

表  4  CHB患者治疗期间HBV DNA和HBsAg动态变化

Table  4.  Dynamic changes of HBV DNA level and HBsAg level in CHB patients during treatment

时间	SVR组(n=58)	LLV组 (n=20)	t值	P值
HBV DNA(lgIU/mL)
基线	5.62±1.69	7.35±1.44	-4.084	＜0.001
12周	2.62±1.261)	4.08±1.221)	-4.526	＜0.001
24周	1.82±0.731)	2.99±0.861)	-5.688	＜0.001
36周	1.43±0.371)	2.73±0.791)	-7.123	＜0.001
48周	1.28±0.341)	2.19±0.651)	-6.266	＜0.001
HBsAg(lgIU/mL)
基线	3.44±0.92	4.53±0.86	-4.652	＜0.001
12周	3.23±0.801)	4.22±0.871)	-4.691	＜0.001
24周	3.16±0.701)	4.11±0.831)	-4.952	＜0.001
36周	3.12±0.661)	3.98±0.771)	-4.804	＜0.001
48周	3.00±0.691)	3.81±0.771)	-4.407	＜0.001
注：与同组基线比较，1)P＜0.05。

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3.   讨论

HBV感染是我国终末期肝病发生的主要原因，而口服NAs仍是抗病毒治疗的主要方法，一些具有强效抑制病毒和低耐药的药物，如ETV、TDF、TAF，已被推荐为一线用药^[10-11]。然而，随着核酸检测技术的不断进步，HBV DNA的检测下限逐渐被突破，越来越多的患者在抗病毒治疗过程中检测到HBV DNA呈低水平复制。日本学者^[12]研究发现经ETV治疗48周的CHB患者，约19.9%的患者HBV DNA阳性，而TDF和TAF单药治疗的患者HBV DNA阳性率分别为21.2%和21.5%^[13]。其他真实世界的研究表明，即使是使用一线抗病毒药物，仍有20%~40%的患者会发生LLV^{[6, 14-15]}，本研究中CHB患者的LLV发生率为25.6%，与既往临床研究结果大致相符。目前，关于NAs经治的CHB患者发生LLV的机制尚未完全明确，可能的机制有：(1)NAs药物竞争性抑制的局限性；(2)宿主免疫功能较弱或未恢复；(3)部分患者肝细胞处于增殖不活跃状态^[15]。

ALT水平可反应宿主免疫状态，在宿主对感染肝细胞的免疫清除过程中，ALT随着免疫反应的增强而逐渐升高，因此高水平的ALT是宿主免疫活跃的标志。有文献^[16]报道，NAs治疗的CHB患者ALT在正常范围内或处于低水平可能与LLV的发生相关。另有研究^[17]发现，ALT＞2倍正常值上限(ULN)的CHB患者经NAs治疗后HBV DNA下降的比例高于ALT在1.3~2×ULN的患者。本研究结果显示，达到SVR的患者在接受NAs抗病毒治疗时的ALT水平＞2×ULN，明显高于发生LLV的患者，说明接受抗病毒治疗时高水平的ALT是发生LLV的保护性因素(OR=0.965，95%CI: 0.937~0.994, P=0.018)。因此，基线高ALT的CHB患者接受抗病毒治疗后可能会获得更好的病毒学应答效果。

HBV DNA可直接反映CHB患者体内病毒复制水平，在患者治疗和随访过程中具有非常重要的作用。一项纳入875例CHB患者的研究^[9]结果显示基线HBV DNA水平与LLV相关。Zhang等^[18]研究发现基线高水平HBV DNA(＞6 lgIU/L)时LLV发生率明显高于基线HBV DNA≤6 lgIU/L患者。本研究中，LLV组患者基线HBV DNA水平显著高于SVR组，基线HBV DNA是LLV发生独立危险因素。进一步对HBV DNA分析结果发现，当基线HBV DNA＞7.29 lgIU/mL时，HBV DNA阴转率会降低，而LLV发生风险将增加8倍以上，提示基线HBV DNA水平越高，发生LLV风险越大。

HBsAg作为HBV感染的重要标志物在临床上广泛应用，HBV感染的不同阶段，HBsAg水平差别甚大。有研究^[19]认为HBsAg是以cccDNA模板合成的，可在一定程度上反映HBV的复制情况。本研究对CHB患者的HBsAg与LLV的相关性分析发现，基线高水平HBsAg是LLV发生独立危险因素，HBsAg越高，HBV DNA阴转率会降低，LLV发生风险越高。这与其他研究的结果大致相同^[20-21]。

HBeAg作为HBV核心基因的一部分，是HBV复制的重要指标。有研究^[22]发现长期ETV经治的CHB患者中LLV患者的阳性率为88.2%，本研究中LLV组患者HBeAg的阳性率达90%，与既往研究大致相符。Kim等^[15]研究发现基线HBeAg阳性是长期ETV经治CHB患者发生LLV的独立危险因素，陈贺等^[22]研究也得出此结论。本研究结果显示，HBeAg阳性并非CHB患者发生LLV的独立危险因素，与上述文献观点有所不同，考虑与本研究中HBeAg阳性和HBeAg阴性患者的基线ALT水平[127.5(54.0~217.0)U/L vs 111.4(44.3~230.0)U/L] 差异无统计学意义(Z=1.214，P=0.225)，两组患者所处的免疫状态有关，其次可能与样本量较少有关。

关于LLV发生预测模型的研究较少，本研究以HBV DNA、HBsAg和ALT构建了LLV发生的预测模型MLLV，结果显示MLLV预测效能最高(AUC=0.931)，敏感度、特异度分别为85.00%、93.10%，为LLV的发生提供了简捷、可靠的预测模型，该模型以反映HBV复制及肝脏炎症为基础构建，可较客观呈现CHB患者肝细胞内病毒复制和肝脏损伤情况，对CHB患者抗病毒治疗的预后有一定的参考价值。进一步对CHB患者血清HBV DNA及HBsAg的动态变化分析发现，抗病毒治疗过程中HBV DNA和HBsAg都呈逐渐下降趋势，但发生LLV的患者HBV DNA及HBsAg水平始终高于SVR患者，随着治疗时间的延长，两者下降的速度也逐渐减慢。Lim等^[23]研究发现，使用NAs抗病毒治疗过程中，HBsAg动态变化是HBsAg清除的有力预测因子。因此，对CHB患者在抗病毒治疗过程中监测血清HBV DNA及HBsAg的动态变化具有重要的意义。

综述所述，基线HBV DNA、HBsAg和ALT是NAs治疗的CHB患者发生LLV的独立影响因素，以此建构的预测模型可以较准确的预测LLV的发生发展。此外，HBV DNA、HBsAg的动态变化对CHB患者抗病毒治疗具有一定的指导作用。但本研究样本量较少，只构建了预测模型，尚未能进行验证模型验证，下一步将扩大样本量，验证该模型及结论，积极探讨LLV的干预措施，并进一步探究其发生的机制，为LLV患者的管理提供参考。