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脂肪非典型钙黏蛋白4在胰腺癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系
DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.12.021
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摘要:
目的 研究脂肪非典型钙黏蛋白4(FAT4)在胰腺癌及其癌旁组织中的表达，分析其与临床病理特征的关系，探索FAT4在胰腺癌发生发展过程中所起的作用。 方法 收集郑州大学附属肿瘤医院2015年1月—2017年1月期间79例行根治性手术切除，且术后病理确诊为胰腺导管腺癌患者的胰腺癌组织及癌旁组织，采用免疫组化法检测FAT4蛋白在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达, 并分析FAT4蛋白表达情况与临床病理特征的关系。等级资料组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman分析。 结果 FAT4蛋白在胰腺癌组织中低表达率为72.15%(52/79)，在癌旁组织中低表达率为21.52%(17/79)，差异有统计学意义(P＜0.001)。患者背痛在FAT4蛋白低表达和高表达间差异有统计学意义(χ2=4.115，P=0.042)。淋巴结转移、神经浸润在FAT4蛋白低表达与高表达间差异均有统计学意义(χ2值分别为8.743、4.925，P值分别为0.003、0.026)。Spearman相关分析结果显示FAT4蛋白表达与胰腺癌的TNM分期、分化程度无关(P值均＞0.05)。 结论 与癌旁组织相比，FAT4蛋白在胰腺癌组织中明显低表达，且与背痛症状、淋巴结转移及神经浸润的发生相关，提示FAT4可能与胰腺癌的发生发展相关。 Abstract:Objective To detect the expression of fat atypical cadherin 4 (FAT4) in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue, and explored the role of FAT4 in the pathogenesis of pancreatic cancer. Methods Pancreatic cancer tissue samples and adjacent tissue samples were collected from 79 patients who underwent radical resection in The Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University from January 2015 to January 2017 and were diagnosed with pancreatic ductal adenocarcinoma based on postoperative pathology. Immunohistochemistry was used to measure the protein expression of FAT4 in pancreatic cancer tissue and adjacent tissue, and the association between FAT4 expression and clinicopathological features was analyzed. The Mann-Whitney U test was used for comparison of ranked data between groups, and the chi-square test was used for comparison of categorical data. A Spearman correlation analysis was used to investigate the correlation between variables. Results The down-regulated expression of FAT4 was detected in 72.15% (52/79) of pancreatic cancer tissue, which was significant higher than that in para-cancer tissues (21.52%, 17/79, P < 0.001). There was a significant difference in backache between the low FAT4 expression group and the high FAT4 expression group (χ2=4.115, P=0.042), and there were also significant differences in lymph node metastasis and perineural invasion between these two groups (χ2=8.743 and 4.925, P=0.003 and 0.026). TNM staging and degree of tumor differentiation were ranked variables, and the analysis of the association between these two variables and FAT4 expression based on Spearman rank correlation coefficient showed that FAT4 expression was not associated with the TNM staging and degree of tumor differentiation of pancreatic cancer (all P > 0.05). Conclusion The expression of FAT4 was significantly down-regulated in pancreatic cancer, suggesting that FAT4 may promote the invasion and infiltration of pancreatic cancer. -
Key words:
- Pancreatic Neoplasms /
- Immunohistochemistry /
- Pathology, Clinical
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肝细胞癌(HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 其恶性程度高, 增殖能力强, 患者预后差。2018年, 全球新发肝癌84.1万例, 在恶性肿瘤发病率排名第6位, 死亡78.1万例[1]; 2015年我国的新发肝癌约37.0万例, 死亡人数约32.6万例[2]。因此, 寻找肝癌预后评估的生物标志物具有重要的临床意义。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD是参与磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的第一种酶, 也是PPP的限速酶, 糖酵解产生的6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下进入PPP, 产生细胞活动所需要的能量[3]。研究发现, G6PD在黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6-7]、肝癌[8-9]、结直肠癌[10]等恶性肿瘤中表达升高, 在肿瘤的发生发展中起重要作用。
淋巴细胞/单核细胞比值(LMR)是反映机体炎症和免疫状态的一项敏感指标, 已被证实可用于预测卵巢癌[11]、肺癌[12]和肝癌[13]等实体肿瘤的预后。本文通过分析G6PD在肝癌组织中的表达与预后的关系, 以及不同G6PD表达水平患者的临床指标差异, 探讨G6PD表达在HCC预后评估中的临床价值。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
收集2016年6月—2018年1月在本院就诊的44例首诊HCC患者的肝癌组织和相应的癌旁组织标本, 及其临床信息和实验室检查结果。纳入标准: (1)所有患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[14]; (2)有完整的基本资料和实验室检测结果(肝肾功能、血常规、凝血指标和肿瘤标志物)。排除标准: (1)合并其他恶性肿瘤或有全身感染症状; (2)术前接受过其他方式治疗。
1.2 仪器试剂
采用贝克曼奥林巴斯5800全自动生化分析仪检测肝肾功能, 贝克曼库尔特全自动血细胞分析仪H750检测血常规。贝克曼ACLTOP检测凝血指标。BeckmanDX1800全自动化学发光仪测定AFP。BIO-RAD荧光定量PCR系统CFX ConnectTM检测基因表达。
1.3 方法
使用Trizol(美国Thermo公司)提取组织RNA。逆转录试剂盒FSQ-301(日本TOYOBO公司)合成cDNA。β-actin为内参基因, 进行qPCR。G6PD: 上游5′-AACATCGCCTGCGTTATCCTC-3′, 下游5′-ACGTCCCGGATGATCCCAA-3′; β-actin: 上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′, 下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTC AGTC-3′。
用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)数据库分析G6PD在HCC组织中的表达。Kaplan Meier Plotter(KM plotter)数据库评估HCC组织中G6PD表达水平与预后。
1.4 伦理学审查
本研究方案经由武汉大学中南医院伦理委员会审批, 批号: 2017058。
1.5 统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行数据分析。正态分布的计量资料以x±s表示, 2组间比较采用t检验; 偏态分布的计量资料以M(P25~P75)表示, 2组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料2组间比较采用Fisher确切概率法; Spearman相关用来分析G6PD与LMR的相关性; 采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 肝癌组织中G6PD mRNA表达
运用RT-qPCR检测44例HCC患者肝癌组织和癌旁肝脏组织中G6PD的mRNA表达水平。结果发现, G6PD mRNA在癌组织中表达明显高于癌旁组织(Z=-3.221, P=0.001), 癌组织G6PD表达水平是癌旁组织的2.09倍(图 1a)。
图 1 肝癌组织中G6PD mRNA表达及其与预后评估注: a, HCC患者癌组织和癌旁组织G6PD mRNA表达水平比较; b, GEPIA数据库中G6PD在肝癌组织中表达; c, G6PD高表达和低表达患者总生存曲线; d, G6PD高表达和低表达患者无进展生存曲线。2.2 低G6PD组和高G6PD组的HCC患者基本资料
根据G6PD mRNA表达水平中位数, 将患者分为G6PD高表达组(n=22)及低表达组(n=22)。两组患者在年龄、性别、HBV DNA检测阳性率和TNM分期上差异均无统计学意义(P值均＞0.05)(表 1)。
表 1 HCC患者低G6PD组和高G6PD组的基本资料指标 低G6PD组(n=22) 高G6PD组(n=22) P值 年龄(岁) 57.04±9.88 52.00±8.74 0.080 男/女(例) 17/5 17/5 1.000 HBV DNA(例) 0.537 ＜500 IU/ml 7 10 ≥500 IU/ml 15 12 TNM分期(例) 0.736 Ⅰ~Ⅱ 15 17 Ⅲ~Ⅳ 7 5 2.3 肝癌患者预后与G6PD表达的关系分析
运用GEPIA数据库分析肝癌组织(n=369)和癌旁组织(n=160)中的G6PD表达。结果发现, G6PD在癌组织中表达明显高于癌旁组织(P＜0.01)(图 1b)。运用KM plotter数据库, 分析两组患者预后差异。结果发现, G6PD高表达是不良预后的危险因素: 总生存期(HR=1.84, 95%CI: 1.30~2.61; P=0.000 52)和无进展生存期(HR=1.75, 95%CI: 1.27~2.42;P=0.000 54), 即G6PD高表达患者预后不良(图 1c、d)。
2.4 肝癌组织中G6PD表达与临床指标的关系
为了进一步比较肝癌患者中G6PD mRNA表达与临床指标的关系, 比较HCC患者低G6PD组(n=22)和高G6PD组(n=22)的肝功能、血常规、凝血功能和AFP差异。
结果显示, LMR在高G6PD组患者中明显低于低G6PD组(P=0.011), 其他指标两组间差异均无统计学意义(P值均＞0.05)(表 2)。
表 2 肝癌患者G6PD表达水平与术前临床指标关系指标 低G6PD组(n=22) 高G6PD组(n=22) 统计值 P值 ALT(U/L) 41.09±28.89 43.64±39.56 t=-0.244 0.809 AST(U/L) 49.00±33.74 47.23±30.33 t=0.183 0.855 总胆红素(μmol/L) 16.60±6.83 20.44±8.93 t=-1.604 0.116 直接胆红素(μmol/L) 4.49±2.82 4.94±2.20 t=-0.579 0.566 间接胆红素(μmol/L) 12.35±4.96 15.05±7.87 t=-1.335 0.187 TP(g/L) 66.80±5.96 67.58±6.27 t=-0.422 0.675 Alb(g/L) 39.66±3.75 39.65±5.63 t=0.006 0.995 Glb(g/L) 27.14±4.17 27.92±4.82 t=-0.575 0.568 GGT(U/L) 61.00±46.68 66.05±43.69 t=-0.366 0.716 ALP(U/L) 103.82±52.41 108.05±56.92 t=-0.256 0.799 WBC(×109/L) 5.35±1.66 5.61±2.34 t=-0.413 0.682 RBC(×1012/L) 4.24±0.85 4.41±0.70 t=-0.691 0.494 HGB(g/L) 129.59±25.11 135.34±18.16 t=-0.844 0.404 PLT(×109/L) 150.10±54.03 173.19±82.75 t=-1.052 0.229 中性粒细胞计数(×109/L) 3.41±1.64 3.80±1.80 t=-0.717 0.478 淋巴细胞计数(×109/L) 1.39±0.55 1.19±0.59 t=1.116 0.271 单核细胞计数(×109/L) 0.42±0.14 0.50±0.21 t=-1.531 0.134 LMR 3.49±1.44 2.45±0.96 t=2.681 0.011 PT(s) 11.59±1.06 11.70±0.88 t=-0.348 0.730 INR 1.06±0.10 1.07±0.08 t=-0.295 0.770 PTTA(%) 97.81±14.29 97.15±15.26 t=0.143 0.887 APTT(s) 32.20±2.78 32.63±3.65 t=-0.433 0.668 TT(s) 14.97±1.22 14.30±1.77 t=1.438 0.158 FIB(mg/dl) 286.61±56.74 308.19±81.70 t=-0.994 0.326 AFP(μg/L) 143.80(6.22~2 386.96) 1 481.35(56.20~4 453.63) Z=-1.723 0.085 2.5 G6PD表达与LMR相关性分析
进一步分析G6PD mRNA表达量与LMR相关性, 结果显示G6PD表达水平与LMR呈负相关(r=-0.439, P=0.005)(图 2), 提示G6PD表达与免疫功能、炎症状态有关。
3. 讨论
HCC是一种进展迅速, 恶性程度高, 预后极差的肿瘤[15]。随着各种分子生物学层面的研究深入, 越来越多的研究表明肝癌的发生发展常伴随着糖代谢紊乱[16]、多种基因表达改变和信号通路异常[17]。
肿瘤细胞由于瓦伯格效应(Warburg effect)主要通过糖酵解的方式分解葡萄糖获能, 所产生的6-磷酸葡萄糖可以通过PPP为核苷酸、脂质等生物分子合成提供前体以及NADPH[16, 18]。本研究发现G6PD基因在HCC中表达明显高于配对癌旁组织。相关研究指出, PI3K/Akt、Ras和Src等促癌信号通路的过度激活, 可通过翻译后调控机制促进G6PD激活[3], 从而引起肿瘤组织中G6PD表达升高, 产生的高水平NADPH可以减少细胞活性氧(ROS)的生成[19]。ROS在多种癌症中被检测到, 一方面被认为可以激活肿瘤信号, 但同时ROS累积也能启动氧化应激诱导肿瘤细胞的死亡, 肿瘤细胞G6PD表达升高, 可以减少升高的ROS, 建立氧化还原平衡[20]。同时细胞内ROS累积会引起NF-κB的激活, 可引起大量细胞因子如IL-6、IL-24、IL-32等的释放, 细胞因子招募单核细胞、巨噬细胞到肿瘤部位, 引起肿瘤微环境炎症反应, 促进肿瘤发展[21]。
已经有研究证实HBV感染会引起G6PD的升高[22], 同时HBV感染可能会引起肿瘤微环境炎症反应, 引起免疫细胞数量和状态改变[23]。而高LMR是多种癌症预后的保护因素[9, 24], 在肝癌的相关研究[25]中, 肝癌术前LMR可分为高值组(≥3.03)和低值组(＜3.03), 高LMR组患者肝癌切除术后5年生存率较好。也有学者[26]指出肝移植术后LMR＜2.75的患者的5年生存率明显低于LMR≥2.75的患者。而本研究发现LMR在G6PD高表达组中明显低于G6PD低表达组, 且肝癌组织中G6PD表达水平与LMR呈负相关, 提示G6PD高表达的HCC患者不良预后可能与肿瘤微环境炎症有关。
综上, 在肝癌组织中高G6PD的表达与不良预后有关, G6PD高表达和低表达组的LMR有明显差异, 且G6PD的表达量与LMR呈负相关, 提示G6PD表达可能与肿瘤微环境炎症反应有关。本研究所用样本量较小, 具体的分子机制尚需进一步研究。
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注：a，FAT4在胰腺癌组织中低表达；b，FAT4在胰腺癌组织中高表达；c，FAT4在癌旁组织中低表达；d，FAT4在癌旁组织中高表达。
图 1 FAT4蛋白在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况(免疫组化，×200)
Figure 1. Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue(immunohistochemistry, ×200)
表 1 FAT4蛋白在胰腺癌和癌旁组织中的表达分布
Table 1. Distribution of FAT4 expression in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue
组别 例数 FAT4蛋白表达情况[例(%)] Z值 P值 - + ++ +++ 胰腺癌组织 79 38(48.10) 19(24.05) 22(27.85) 0 7.496 ＜0.001 癌旁组织 79 4(5.06) 13(16.45) 37(46.84) 25(31.65) 
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表 2 FAT4在胰腺癌和癌旁组织中的表达
Table 2. Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue
组别 例数 FAT4低表达[例(%)] FAT4高表达[例(%)] χ2值 P值 胰腺癌组织 79 57(72.15) 22(27.85) 40.669 ＜0.001 癌旁组织 79 17(21.52) 62(78.48)
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表 3 FAT4蛋白表达与胰腺癌患者的一般临床情况
Table 3. Correlations between FAT4 expression and clinical features in pancreatic cancer patients
指标 例数 FAT4低表达 FAT4高表达 χ2值 P值 性别[例(%)] 0.494 0.482 男 48 36(75.00) 12(25.00) 女 31 21(67.74) 10(32.26) 年龄[例(%)] 0.603 0.438 ＜60岁 56 39(69.64) 17(30.36) ≥60岁 23 18(78.26) 5(21.74) 术前黄疸[例(%)] 3.250 0.071 有 61 41(67.21) 20(32.79) 无 18 16(88.89) 2(11.11) 背痛[例(%)] 4.115 0.042 有 36 30(83.33) 6(16.67) 无 43 27(62.79) 16(37.21) 术前空腹血糖[例(%)] 1.566 0.211 正常 45 30(66.67) 15(33.33) 升高 34 27(79.41) 7(20.59)
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表 4 FAT4蛋白表达与临床病理特征的关系
Table 4. Correlations between FAT4 expression and clinicopathological characteristics in pancreatic cancer patients
病理学特征 例数 FAT4低表达[例(%)] FAT4高表达[例(%)] χ2值 P值 肿瘤位置 0.029 0.864 胰头 60 46(76.67) 14(23.33) 胰体尾 19 11(57.89) 8(26.32) 肿瘤大小 2.688 0.101 ≤4 cm 54 42(77.78) 12(22.23) ＞4 cm 25 15(60.00) 10(40.00) 淋巴结转移 8.743 0.003 有 46 39(84.78) 7(15.22) 无 33 18(54.55) 15(45.45) 神经侵犯 4.925 0.026 有 41 34(82.93) 7(17.07) 无 38 23(60.53) 15(39.47) 分化程度 4.866 0.088 高分化 15 8(53.33) 7(46.67) 中分化 42 30(71.43) 12(28.57) 低分化 22 19(86.36) 3(13.64) TNM分期 1.913 0.384 Ⅰ期 24 15(62.50) 9(37.50) Ⅱ期 49 38(77.55) 11(22.45)
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表 5 FAT4蛋白表达与TNM分期的关系
Table 5. Correlations between FAT4 expression and TNM stage
TNM分期 例数 FAT4表达水平[例(%)] r值 P值 - + ++ +++ Ⅰ期 24 6(25.00) 9(37.50) 9(37.50) 0 Ⅱ期 49 29(59.18) 9(18.37) 11(22.45) 0 0.344 0.365 Ⅲ期 6 3(50.00) 1(16.67) 2(33.33) 0 Ⅳ期 0 0 0 0 0
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表 6 FAT4蛋白表达与肿瘤组织学类型的关系
Table 6. Correlations between FAT4 expression and TNM stage
组织学分级 例数 FAT4表达水平[例(%)] r值 P值 - + ++ +++ 高分化 15 3(20.00) 5(33.33) 7(46.67) 0 中分化 42 15(35.71) 15(35.71) 12(28.57) 0 0.305 0.424 低分化 22 16(72.73) 3(13.64) 3(13.64) 0
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