Resistance-associated variants in the non-structural protein 5B region in patients with hepatitis C virus genotype 1b infection in Guangxi, China

全球有超过2.4亿慢性HBV感染者，若不及时进行有效、规范的治疗，15%~40%的患者会进展为肝硬化，最终导致肝衰竭和肝细胞癌(HCC)^[1]。虽然乙型肝炎疫苗的接种使HBV感染的患病率逐年下降，但多数亚洲地区仍归为中至高流行区。我国HBsAg流行率为5%~6%，但因为人口基数大，所以仍存在许多的慢性HBV感染者，其中需要治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者约有2000万~3000万^[2-3]；因此慢性HBV感染依然是我国的重大公共卫生问题。当前用于抗病毒治疗的核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues, NAs)虽可有效抑制病毒复制，延缓疾病进展，但对肝细胞核内的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)均无明确作用，使得病毒无法完全清除。cccDNA作为HBV复制的原始模板，检测肝内cccDNA水平是评价抗病毒疗效及停止治疗的重要指标^[4-5]，由于肝活检为侵入性操作，cccDNA在肝组织内分布不均，松弛环状双链DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)的存在影响cccDNA含量等因素导致cccDNA检测难以在临床广泛开展^[6-7]。因此需要寻找能反映肝内cccDNA活性且方便操作的临床替代指标。近年来HBV RNA作为新的血清学标志物被广泛提出，因为其只能来自肝内cccDNA, 所以能更好的反映HBV转录活性，本研究主要探讨血清HBV RNA在HBeAg阳性CHB患者不同时期的表达水平及检测价值。

1.   资料与方法

1.1   研究对象

收集2019年8月—2020年12月在杭州市西溪医院肝病科门诊及住院部诊治的CHB患者，纳入标准：(1)诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》^[8]；(2)准备接受或已接受NAs抗病毒治疗。排除标准：(1)合并HAV、HCV、巨细胞病毒等其他嗜肝病毒感染；(2)合并HIV感染；(3)HCC患者；(4)代谢性肝病、自身免疫性肝病及近期使用肝损伤性药物者；(5)合并其他系统恶性肿瘤或严重疾病者；(6)研究者认为不适合入组的其他情况。

1.2   实验室检测

本研究使用的HBV RNA定量检测试剂盒由湖南圣湘科技有限公司提供，检测原理通过逆转录HBV核酸中的pgRNA(经DNA酶消化)，利用针对HBV pgRNA序列设计的一组特异性引物与荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用一步法RT实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HBV pgRNA的定量检测，HBV RNA检测下限为50拷贝/mL。应用化学发光免疫分析法在美国雅培Alinity i全自动化学发光免疫分析仪上行HBV血清学标志物检测；用HBV DNA定量检测试剂盒，在ABI7500荧光定量PCR仪上行HBV DNA检测；HBV DNA检测下限为30 IU/mL；用Beckman Coulter AU5831全自动生化分析仪检测ALT(正常范围9~50 U/L)、AST(正常范围15~40 U/L)。

1.3   伦理学审查

本研究经杭州市西溪医院伦理委员会批准, 批号：2019年(科)伦审第21号，所有患者均签署知情同意书。

1.4   统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计学处理，正态分布的计量资料用x ±s表示，2组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料用M(P₂₅~P₇₅)表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料组间比较采用χ²检验；采用Pearson或Spearman相关分析描述两变量间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   一般资料

本研究共纳入61例CHB患者，平均年龄(39.95±9.88)岁。按HBeAg及HBV DNA状态分为3组：HBeAg阳性CHB[HBeAg(+)、HBV DNA(+)]未治患者，HBeAg血清学转换前[HBeAg(+)、HBV DNA(-)]经治患者，HBeAg血清学转换后[HBeAg(-)、HBV DNA(-)]经治患者(表 1)。

表  1  纳入患者分组情况及基线资料

组别	例数	男	女	年龄(岁)
HBeAg(+)、HBV DNA(+)	22	13	9	35.36±7.55
HBeAg(+)、HBV DNA(-)	17	11	6	39.35±7.98
HBeAg(-)、HBV DNA(-)	22	13	9	45.00±11.16

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2.2   不同时期血清HBV RNA的表达水平

HBeAg阳性CHB未治患者血清HBV RNA阳性率100%(22/22)，HBV RNA载量最大值为9 log₁₀拷贝/mL，平均为7 log₁₀拷贝/mL；HBeAg血清学转换前经治患者血清HBV RNA阳性率88.2%(15/17)，HBV RNA载量最大值为5 log₁₀拷贝/mL，平均4 log₁₀拷贝/mL；HBeAg血清学转换后经治患者血清HBV RNA阳性率22.7%(6/22)，HBV RNA载量最大值为4 log₁₀拷贝/mL。

2.3   经治HBeAg阳性组与HBeAg阴性组血清学指标比较

经治HBeAg阳性组的HBV RNA阳性率显著高于HBeAg阴性组，差异有统计学意义(P＜0.001), 2组间HBV RNA、HBsAg水平比较，差异均有统计学意义(P值均＜0.05)(表 2)。

表  2  经治患者HBeAg阳性组与HBeAg阴性组临床资料比较

项目	HBeAg阳性组(n=17)	HBeAg阴性组(n=22)	统计值	P值
男/女(例)	11/6	13/9		0.753
年龄(岁)	39.35±7.98	45.00±11.16	t=-1.77	0.086
HBV RNA阳性[例(%)]	15(88.2)	6(27.3)		＜0.001
HBV RNA(log10拷贝/mL)	4.05(3.01~5.18)	1.40(1.40~1.83)	Z=-4.44	＜0.001
HBsAg(log10IU/mL)	3.24(2.86~3.50)	2.76(2.07~3.35)	Z=-2.41	0.016
ALT(U/L)	22.24±10.83	25.09±11.76	t=-0.78	0.442
AST(U/L)	23.00±4.48	23.9±14.23	t=-0.65	0.521

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2.4   HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组血清学指标比较

CHB患者NAs治疗实现HBV DNA阴转时，肝功能复常，ALT、AST水平降低，HBV RNA、HBsAg水平也均有所降低(P值均＜0.001)(表 3)。对于治疗后HBV DNA阴转的CHB患者，Spearman相关分析示，血清HBV RNA与血清HBsAg无相关性(P=0.091)。

表  3  HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组临床资料比较

项目	HBV DNA阳性组(n=22)	HBV DNA阴性组(n=39)	统计值	P值
男/女(例)	13/9	24/15	χ2=0.035	0.851
年龄(岁)	35.36±7.55	42.54±10.18	t=-2.88	0.005
HBV RNA(log10拷贝/mL)	7.62(6.51~8.55)	1.94(1.40~4.04)	Z=-6.16	＜0.001
HBsAg(log10IU/mL)	3.94(3.26~4.23)	2.90(2.61~3.44)	Z=-4.07	＜0.001
ALT(U/L)	249.50(114.25~664.50)	20.00(16.00~31.00)	Z=-6.45	＜0.001
AST(U/L)	106.00(63.75~418.75)	23.00(21.00~27.00)	Z=-6.45	＜0.001
HBV DNA(log10IU/ml)	7.21±1.23	-

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2.5   不同时期HBV RNA与HBsAg、HBV DNA的相关性

在HBeAg阳性CHB未治患者中，HBV RNA与HBsAg(r=0.612，P＜0.01)、HBV DNA(r=0.922, P＜0.01)均具有较强的相关性(图 1)；在HBeAg血清学转换前和HBeAg血清学转换后的经治患者中，HBV RNA与HBsAg无相关性(P＞0.05)；3组患者HBV RNA与年龄、ALT、AST均无相关性(P值均＞0.05)。

图  1  HBeAg阳性CHB未治患者HBV RNA与HBsAg、HBV DNA的相关性

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3.   讨论

CHB是导致肝硬化、肝衰竭、HCC的主要危险因素，每年约有80万人死于HBV感染相关性疾病^[9]，因此如何有效的管理CHB患者仍是当前临床工作的热点和难点。随着对HBV RNA的研究深入，已知HBV感染患者血清中的HBV RNA就是前基因组RNA(pgRNA)，即3.5 kb mRNA；pgRNA是HBV复制的中间产物，利用cccDNA作为模板在病毒核衣壳内转录，最后释放完整的子代病毒，因此血清HBV RNA与HBsAg不同，其只能来自于肝内cccDNA；而NAs是通过取代HBV复制过程中聚合酶区的核苷来抑制病毒复制，并不能影响cccDNA转录生成mRNA，由此可以推断HBV RNA与肝内cccDNA相关，检测外周血HBV RNA水平可以反映肝内cccDNA的转录活性。因此相比于HBsAg、HBV DNA等传统的血清学指标，血清HBV RNA水平可以更好的反映肝内病毒复制水平，其能作为CHB患者管理的新型标志物^[10-11]。

HBeAg阳性CHB患者在接受抗病毒药物治疗后会逐步实现HBV DNA阴转、HBeAg血清学转换等目标，本研究通过观察HBeAg阳性的CHB患者不同时期的HBV RNA表达水平，发现未治疗的22例CHB患者血清中均能检测出较高的血清HBV RNA水平；39例治疗后HBV DNA阴转的CHB患者中仍有21例可以检测出HBV RNA，这表明在评估病毒复制方面HBV RNA比HBV DNA更灵敏，即使是在HBV DNA持续低于检测下限且发生HBeAg血清学转换也有部分患者血清HBV RNA阳性，意味HBeAg的消失只能表示病毒复制减弱，肝内cccDNA仍可能存在低水平的转录。

对HBeAg阳性CHB患者而言，发生HBeAg血清学转换是比较满意的终点，是发生HBsAg阴转的基本条件。本文通过比较治疗后HBV DNA阴转的HBeAg阳性组与HBeAg阴性组，发现HBeAg阳性组HBV RNA阳性率显著高于HBeAg阴性组(88.2% vs 27.3%)，两组间HBV RNA、HBsAg水平差异也具有统计学意义，因HBV RNA只能来自于肝内cccDNA, 提示HBeAg阳性CHB患者肝内cccDNA转录活性更高。因此临床上对HBeAg阳性的CHB患者要努力实现HBeAg血清学转换。

通过分析HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组患者，发现接受NAs治疗后HBV DNA、HBV RNA均会发生下降，这是因为NAs类药物抑制pgRNA的逆转录，致使DNA合成受阻，而长时间接受NAs治疗使rcDNA的形成受到抑制，影响cccDNA池的回补，被感染的肝细胞数量减少，进一步导致HBV RNA的生成也减少；另外接受NAs治疗的CHB人群在病毒清除的过程中可能会促进机体免疫应答的能力从而减少cccDNA池。但是在临床上发现即使CHB患者经过长期NAs抗病毒治疗，能实现完全治愈的患者极为罕见，可能是只需要极少部分逆转录酶存在活性就能对cccDNA池进行补充，因此对大部分CHB患者而言需要长期口服NAs抗病毒治疗。

本研究发现，未接受治疗的CHB患者HBV RNA与HBsAg(r=0.612，P＜0.01)、HBV DNA(r=0.922, P＜0.01)均具有较强的正相关，这种血清学间良好的相关性有助于基层医院或者医疗资源匮乏地区，使用HBsAg定量水平反映HBeAg阳性CHB患者体内病毒复制水平，而另外两组HBV DNA阴性的CHB患者HBV RNA与HBsAg无相关性，这与Mak等^[12]的研究结果一致，随着治疗时间的延长，HBV RNA与HBsAg相关性逐渐下降，从一定程度反映了治疗后的HBsAg水平不能准确反映肝内cccDNA转录活性。

综上所述，对未接受抗病毒治疗的CHB患者，血清HBV RNA与其他血清学标志物有一定的相关性，对NAs治疗后HBV DNA阴转的患者有望使用HBV RNA继续监测肝内病毒复制活性，为CHB患者长期抗病毒治疗提供依据。但本研究样本量较少，相关结论有待进一步证实，后续可以在未治疗组继续纳入合适患者并进行前瞻性队列研究，观察HBeAg阳性CHB患者在NAs治疗过程中HBV RNA的动态变化。