组别 | 例数 | 男 | 女 | 年龄(岁) |
HBeAg(+)、HBV DNA(+) | 22 | 13 | 9 | 35.36±7.55 |
HBeAg(+)、HBV DNA(-) | 17 | 11 | 6 | 39.35±7.98 |
HBeAg(-)、HBV DNA(-) | 22 | 13 | 9 | 45.00±11.16 |
全球有超过2.4亿慢性HBV感染者,若不及时进行有效、规范的治疗,15%~40%的患者会进展为肝硬化,最终导致肝衰竭和肝细胞癌(HCC)[1]。虽然乙型肝炎疫苗的接种使HBV感染的患病率逐年下降,但多数亚洲地区仍归为中至高流行区。我国HBsAg流行率为5%~6%,但因为人口基数大,所以仍存在许多的慢性HBV感染者,其中需要治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者约有2000万~3000万[2-3];因此慢性HBV感染依然是我国的重大公共卫生问题。当前用于抗病毒治疗的核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues, NAs)虽可有效抑制病毒复制,延缓疾病进展,但对肝细胞核内的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)均无明确作用,使得病毒无法完全清除。cccDNA作为HBV复制的原始模板,检测肝内cccDNA水平是评价抗病毒疗效及停止治疗的重要指标[4-5],由于肝活检为侵入性操作,cccDNA在肝组织内分布不均,松弛环状双链DNA(relaxed circularDNA,rcDNA)的存在影响cccDNA含量等因素导致cccDNA检测难以在临床广泛开展[6-7]。因此需要寻找能反映肝内cccDNA活性且方便操作的临床替代指标。近年来HBV RNA作为新的血清学标志物被广泛提出,因为其只能来自肝内cccDNA, 所以能更好的反映HBV转录活性,本研究主要探讨血清HBV RNA在HBeAg阳性CHB患者不同时期的表达水平及检测价值。
收集2019年8月—2020年12月在杭州市西溪医院肝病科门诊及住院部诊治的CHB患者,纳入标准:(1)诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[8];(2)准备接受或已接受NAs抗病毒治疗。排除标准:(1)合并HAV、HCV、巨细胞病毒等其他嗜肝病毒感染;(2)合并HIV感染;(3)HCC患者;(4)代谢性肝病、自身免疫性肝病及近期使用肝损伤性药物者;(5)合并其他系统恶性肿瘤或严重疾病者;(6)研究者认为不适合入组的其他情况。
本研究使用的HBV RNA定量检测试剂盒由湖南圣湘科技有限公司提供,检测原理通过逆转录HBV核酸中的pgRNA(经DNA酶消化),利用针对HBV pgRNA序列设计的一组特异性引物与荧光探针,配以PCR反应液,在荧光定量PCR仪上,应用一步法RT实时荧光定量PCR检测技术,通过荧光信号的变化实现HBV pgRNA的定量检测,HBV RNA检测下限为50拷贝/mL。应用化学发光免疫分析法在美国雅培Alinity i全自动化学发光免疫分析仪上行HBV血清学标志物检测;用HBV DNA定量检测试剂盒,在ABI7500荧光定量PCR仪上行HBV DNA检测;HBV DNA检测下限为30 IU/mL;用Beckman Coulter AU5831全自动生化分析仪检测ALT(正常范围9~50 U/L)、AST(正常范围15~40 U/L)。
本研究经杭州市西溪医院伦理委员会批准, 批号:2019年(科)伦审第21号,所有患者均签署知情同意书。
采用SPSS 25.0进行统计学处理,正态分布的计量资料用x ±s表示,2组间比较采用独立样本t检验;非正态分布的计量资料用M(P25~P75)表示,2组间比较采用Mann-Whitney U检验;计数资料组间比较采用χ2检验;采用Pearson或Spearman相关分析描述两变量间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
本研究共纳入61例CHB患者,平均年龄(39.95±9.88)岁。按HBeAg及HBV DNA状态分为3组:HBeAg阳性CHB[HBeAg(+)、HBV DNA(+)]未治患者,HBeAg血清学转换前[HBeAg(+)、HBV DNA(-)]经治患者,HBeAg血清学转换后[HBeAg(-)、HBV DNA(-)]经治患者(表 1)。
组别 | 例数 | 男 | 女 | 年龄(岁) |
HBeAg(+)、HBV DNA(+) | 22 | 13 | 9 | 35.36±7.55 |
HBeAg(+)、HBV DNA(-) | 17 | 11 | 6 | 39.35±7.98 |
HBeAg(-)、HBV DNA(-) | 22 | 13 | 9 | 45.00±11.16 |
HBeAg阳性CHB未治患者血清HBV RNA阳性率100%(22/22),HBV RNA载量最大值为9 log10拷贝/mL,平均为7 log10拷贝/mL;HBeAg血清学转换前经治患者血清HBV RNA阳性率88.2%(15/17),HBV RNA载量最大值为5 log10拷贝/mL,平均4 log10拷贝/mL;HBeAg血清学转换后经治患者血清HBV RNA阳性率22.7%(6/22),HBV RNA载量最大值为4 log10拷贝/mL。
经治HBeAg阳性组的HBV RNA阳性率显著高于HBeAg阴性组,差异有统计学意义(P<0.001), 2组间HBV RNA、HBsAg水平比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表 2)。
项目 | HBeAg阳性组(n=17) | HBeAg阴性组(n=22) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 11/6 | 13/9 | 0.753 | |
年龄(岁) | 39.35±7.98 | 45.00±11.16 | t=-1.77 | 0.086 |
HBV RNA阳性[例(%)] | 15(88.2) | 6(27.3) | <0.001 | |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 4.05(3.01~5.18) | 1.40(1.40~1.83) | Z=-4.44 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.24(2.86~3.50) | 2.76(2.07~3.35) | Z=-2.41 | 0.016 |
ALT(U/L) | 22.24±10.83 | 25.09±11.76 | t=-0.78 | 0.442 |
AST(U/L) | 23.00±4.48 | 23.9±14.23 | t=-0.65 | 0.521 |
CHB患者NAs治疗实现HBV DNA阴转时,肝功能复常,ALT、AST水平降低,HBV RNA、HBsAg水平也均有所降低(P值均<0.001)(表 3)。对于治疗后HBV DNA阴转的CHB患者,Spearman相关分析示,血清HBV RNA与血清HBsAg无相关性(P=0.091)。
项目 | HBV DNA阳性组(n=22) | HBV DNA阴性组(n=39) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 13/9 | 24/15 | χ2=0.035 | 0.851 |
年龄(岁) | 35.36±7.55 | 42.54±10.18 | t=-2.88 | 0.005 |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 7.62(6.51~8.55) | 1.94(1.40~4.04) | Z=-6.16 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.94(3.26~4.23) | 2.90(2.61~3.44) | Z=-4.07 | <0.001 |
ALT(U/L) | 249.50(114.25~664.50) | 20.00(16.00~31.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
AST(U/L) | 106.00(63.75~418.75) | 23.00(21.00~27.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
HBV DNA(log10IU/ml) | 7.21±1.23 | - |
在HBeAg阳性CHB未治患者中,HBV RNA与HBsAg(r=0.612,P<0.01)、HBV DNA(r=0.922, P<0.01)均具有较强的相关性(图 1);在HBeAg血清学转换前和HBeAg血清学转换后的经治患者中,HBV RNA与HBsAg无相关性(P>0.05);3组患者HBV RNA与年龄、ALT、AST均无相关性(P值均>0.05)。
CHB是导致肝硬化、肝衰竭、HCC的主要危险因素,每年约有80万人死于HBV感染相关性疾病[9],因此如何有效的管理CHB患者仍是当前临床工作的热点和难点。随着对HBV RNA的研究深入,已知HBV感染患者血清中的HBV RNA就是前基因组RNA(pgRNA),即3.5 kb mRNA;pgRNA是HBV复制的中间产物,利用cccDNA作为模板在病毒核衣壳内转录,最后释放完整的子代病毒,因此血清HBV RNA与HBsAg不同,其只能来自于肝内cccDNA;而NAs是通过取代HBV复制过程中聚合酶区的核苷来抑制病毒复制,并不能影响cccDNA转录生成mRNA,由此可以推断HBV RNA与肝内cccDNA相关,检测外周血HBV RNA水平可以反映肝内cccDNA的转录活性。因此相比于HBsAg、HBV DNA等传统的血清学指标,血清HBV RNA水平可以更好的反映肝内病毒复制水平,其能作为CHB患者管理的新型标志物[10-11]。
HBeAg阳性CHB患者在接受抗病毒药物治疗后会逐步实现HBV DNA阴转、HBeAg血清学转换等目标,本研究通过观察HBeAg阳性的CHB患者不同时期的HBV RNA表达水平,发现未治疗的22例CHB患者血清中均能检测出较高的血清HBV RNA水平;39例治疗后HBV DNA阴转的CHB患者中仍有21例可以检测出HBV RNA,这表明在评估病毒复制方面HBV RNA比HBV DNA更灵敏,即使是在HBV DNA持续低于检测下限且发生HBeAg血清学转换也有部分患者血清HBV RNA阳性,意味HBeAg的消失只能表示病毒复制减弱,肝内cccDNA仍可能存在低水平的转录。
对HBeAg阳性CHB患者而言,发生HBeAg血清学转换是比较满意的终点,是发生HBsAg阴转的基本条件。本文通过比较治疗后HBV DNA阴转的HBeAg阳性组与HBeAg阴性组,发现HBeAg阳性组HBV RNA阳性率显著高于HBeAg阴性组(88.2% vs 27.3%),两组间HBV RNA、HBsAg水平差异也具有统计学意义,因HBV RNA只能来自于肝内cccDNA, 提示HBeAg阳性CHB患者肝内cccDNA转录活性更高。因此临床上对HBeAg阳性的CHB患者要努力实现HBeAg血清学转换。
通过分析HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组患者,发现接受NAs治疗后HBV DNA、HBV RNA均会发生下降,这是因为NAs类药物抑制pgRNA的逆转录,致使DNA合成受阻,而长时间接受NAs治疗使rcDNA的形成受到抑制,影响cccDNA池的回补,被感染的肝细胞数量减少,进一步导致HBV RNA的生成也减少;另外接受NAs治疗的CHB人群在病毒清除的过程中可能会促进机体免疫应答的能力从而减少cccDNA池。但是在临床上发现即使CHB患者经过长期NAs抗病毒治疗,能实现完全治愈的患者极为罕见,可能是只需要极少部分逆转录酶存在活性就能对cccDNA池进行补充,因此对大部分CHB患者而言需要长期口服NAs抗病毒治疗。
本研究发现,未接受治疗的CHB患者HBV RNA与HBsAg(r=0.612,P<0.01)、HBV DNA(r=0.922, P<0.01)均具有较强的正相关,这种血清学间良好的相关性有助于基层医院或者医疗资源匮乏地区,使用HBsAg定量水平反映HBeAg阳性CHB患者体内病毒复制水平,而另外两组HBV DNA阴性的CHB患者HBV RNA与HBsAg无相关性,这与Mak等[12]的研究结果一致,随着治疗时间的延长,HBV RNA与HBsAg相关性逐渐下降,从一定程度反映了治疗后的HBsAg水平不能准确反映肝内cccDNA转录活性。
综上所述,对未接受抗病毒治疗的CHB患者,血清HBV RNA与其他血清学标志物有一定的相关性,对NAs治疗后HBV DNA阴转的患者有望使用HBV RNA继续监测肝内病毒复制活性,为CHB患者长期抗病毒治疗提供依据。但本研究样本量较少,相关结论有待进一步证实,后续可以在未治疗组继续纳入合适患者并进行前瞻性队列研究,观察HBeAg阳性CHB患者在NAs治疗过程中HBV RNA的动态变化。
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组别 | 例数 | 男 | 女 | 年龄(岁) |
HBeAg(+)、HBV DNA(+) | 22 | 13 | 9 | 35.36±7.55 |
HBeAg(+)、HBV DNA(-) | 17 | 11 | 6 | 39.35±7.98 |
HBeAg(-)、HBV DNA(-) | 22 | 13 | 9 | 45.00±11.16 |
项目 | HBeAg阳性组(n=17) | HBeAg阴性组(n=22) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 11/6 | 13/9 | 0.753 | |
年龄(岁) | 39.35±7.98 | 45.00±11.16 | t=-1.77 | 0.086 |
HBV RNA阳性[例(%)] | 15(88.2) | 6(27.3) | <0.001 | |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 4.05(3.01~5.18) | 1.40(1.40~1.83) | Z=-4.44 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.24(2.86~3.50) | 2.76(2.07~3.35) | Z=-2.41 | 0.016 |
ALT(U/L) | 22.24±10.83 | 25.09±11.76 | t=-0.78 | 0.442 |
AST(U/L) | 23.00±4.48 | 23.9±14.23 | t=-0.65 | 0.521 |
项目 | HBV DNA阳性组(n=22) | HBV DNA阴性组(n=39) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 13/9 | 24/15 | χ2=0.035 | 0.851 |
年龄(岁) | 35.36±7.55 | 42.54±10.18 | t=-2.88 | 0.005 |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 7.62(6.51~8.55) | 1.94(1.40~4.04) | Z=-6.16 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.94(3.26~4.23) | 2.90(2.61~3.44) | Z=-4.07 | <0.001 |
ALT(U/L) | 249.50(114.25~664.50) | 20.00(16.00~31.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
AST(U/L) | 106.00(63.75~418.75) | 23.00(21.00~27.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
HBV DNA(log10IU/ml) | 7.21±1.23 | - |
组别 | 例数 | 男 | 女 | 年龄(岁) |
HBeAg(+)、HBV DNA(+) | 22 | 13 | 9 | 35.36±7.55 |
HBeAg(+)、HBV DNA(-) | 17 | 11 | 6 | 39.35±7.98 |
HBeAg(-)、HBV DNA(-) | 22 | 13 | 9 | 45.00±11.16 |
项目 | HBeAg阳性组(n=17) | HBeAg阴性组(n=22) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 11/6 | 13/9 | 0.753 | |
年龄(岁) | 39.35±7.98 | 45.00±11.16 | t=-1.77 | 0.086 |
HBV RNA阳性[例(%)] | 15(88.2) | 6(27.3) | <0.001 | |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 4.05(3.01~5.18) | 1.40(1.40~1.83) | Z=-4.44 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.24(2.86~3.50) | 2.76(2.07~3.35) | Z=-2.41 | 0.016 |
ALT(U/L) | 22.24±10.83 | 25.09±11.76 | t=-0.78 | 0.442 |
AST(U/L) | 23.00±4.48 | 23.9±14.23 | t=-0.65 | 0.521 |
项目 | HBV DNA阳性组(n=22) | HBV DNA阴性组(n=39) | 统计值 | P值 |
男/女(例) | 13/9 | 24/15 | χ2=0.035 | 0.851 |
年龄(岁) | 35.36±7.55 | 42.54±10.18 | t=-2.88 | 0.005 |
HBV RNA(log10拷贝/mL) | 7.62(6.51~8.55) | 1.94(1.40~4.04) | Z=-6.16 | <0.001 |
HBsAg(log10IU/mL) | 3.94(3.26~4.23) | 2.90(2.61~3.44) | Z=-4.07 | <0.001 |
ALT(U/L) | 249.50(114.25~664.50) | 20.00(16.00~31.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
AST(U/L) | 106.00(63.75~418.75) | 23.00(21.00~27.00) | Z=-6.45 | <0.001 |
HBV DNA(log10IU/ml) | 7.21±1.23 | - |