Evaluation of adefovir primary resistance and adefovir repulsive mutations of the HBV DNA P gene in chronic hepatitis B patients

轻微型肝性脑病(minimal hepatic encephalopathy, MHE)是指临床上没有显性肝性脑病症状，但有脑代谢、运动、注意和神经认知功能缺陷的一组肝硬化患者^[1-3]。研究^[4]表明MHE在肝硬化患者中的发生率高达35%~94%，如不早期进行干预，随着病情的加重，其发展为显性肝性脑病的概率很高^[5]。Fichet等^[6]发现显性肝性脑病的病死率约为78%，因此，早期发现MHE对于及时治疗和改善患者预后至关重要。目前，MHE的诊断是临床医生面临的难题，主要通过神经心理学评分进行，其操作繁琐耗时，易受年龄和教育水平等因素的影响^[7]，临床诊断可靠性欠佳。因此，寻找MHE早期诊断及预测相对特异及有效的生物标志物成为临床的迫切需要。

血清胆碱酯酶称为假胆碱酯酶或非特异性胆碱酯酶，是一种催化胆碱酯水解的丝氨酸水解酶^[8]。胆碱酯酶的合成能力是评估肝脏蛋白质合成功能的主要指标^[9]，肝损伤时，胆碱酯酶活性降低。血清胆碱酯酶的独特之处在于它只由肝脏合成，较少受到其他因素的干扰，在肝损伤检测中具有较高的敏感度和特异度，是肝脏疾病诊断及判断预后的一项灵敏指标^[9]。氨被认为是MHE发展的主要血清学标志物^[10]，肝脏是氨的主要代谢部位，肝损伤时会导致外周血氨浓度升高^[11]，穿过血脑屏障导致神经递质合成紊乱、影响中枢神经系统能量代谢和炎症反应，从而导致肝性脑病的发生^[12-13]。因此，假设胆碱酯酶和血氨在鉴别肝硬化合并MHE患者时比常规血液标志物更有效，并且与认知损害相关。

1.   资料与方法

1.1   研究对象

前瞻性纳入2020年4月—2022年2月于宁夏医科大学总医院感染疾病科住院治疗，并经临床表现、实验室检查、影像学检查或肝穿刺活检确诊为乙型肝炎肝硬化患者。纳入标准：(1)年龄在18~70岁；(2)肝硬化诊断符合2019年《肝硬化诊治指南》^[14]；(3)MHE诊断符合《中国肝性脑病诊治共识意见(2013年，重庆)》^[15]。排除标准: (1)既往有神经系统疾病史；(2)患有糖尿病、高血压等其他慢性疾病史；(3)患有严重的心、肾、肺疾病；(4)患有肝癌、HCV等肝炎病毒感染；(5)合并其他原因引起的肝硬化[酒精性、胆汁淤积性、药物或化学毒物、自身免疫性寄生虫感染性、遗传代谢性、营养障碍性(脂肪肝)]；(6)由急性肝衰竭引起的肝性脑病或其他原因(中毒性脑病、代谢性脑病、颅内出血、肿瘤、感染等)引起的精神和行为异常；(7)由于视力障碍或教育程度等原因无法完成数字连接试验A (number connection test-A, NCT-A)及数字符号试验(digital symbol test, DST)量表评估。

1.2   神经心理学量表评估

患者于入院后在安静且光照充足的房间内完成神经心理学量表，所有受试者由同一位医师进行测量。根据2013年中国肝性脑病诊治共识意见^[15]，NCT-A及DST两项测试结果均为阳性者纳入MHE组。NCT-A及DST阳性范围根据Wang等^[16]使用NCT-A及DST制定出不同年龄段正常参考值范围而确定。

1.3   实验室检查

所有受试者的标本均为晨起空腹血清。静脉抽血采样前1天嘱患者禁止饮酒。使用肝素抗凝管采集标本，采集后立即置冰浴中随即离心送检。ALT、AST、GGT、ALP、TBil、白蛋白、血氨和胆碱酯酶在日立7060自动生化分析仪检测，并通过全自动血凝仪和配套试剂检测患者的凝血酶原时间。

1.4   统计学方法

使用SPSS 23.0和MedCalc统计学软件进行数据处理。计数资料2组间比较采用χ²检验；根据Kolmogorov-Smirnov检验对所有数据进行正态性检验，对于正态分布的计量资料采用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用M(P₂₅~P₇₅)表示，2组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。采用Logistic回归分析各变量与MHE的关系，并进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，探讨各变量对肝硬化合并MHE的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   所有受试者临床资料及生化指标比较

共收集81例肝硬化患者，所有受试者人口学资料如表 1所示。与肝硬化组相比，MHE组在性别比例、年龄、教育水平上差异均无统计学意义。与肝硬化组相比，MHE组NCT-A量表评分升高、DST量表评分降低(P值均＜0.001)；AST、血氨、凝血酶原时间水平较高，白蛋白和胆碱酯酶水平降低(P值均＜0.05)。

表  1  肝硬化组及MHE组患者的一般资料比较

Table  1.  General information of liver cirrhosis and MHE group

项目	肝硬化组(n=45)	MHE组(n=36)	统计值	P值
男/女(例)	30/15	23/13	χ2=0.068	0.749
年龄(年)	48.5±8.5	50.3±9.7	t=-0.856	0.395
教育水平(年)	7.8±1.8	7.7±1.9	t=0.335	0.738
NCT-A(s)	39.5(32.8~44.8)	70.7(60.2~84.6)	Z=-7.110	0.001
DST(分)	43.0±9.8	21.2±4.7	t=12.223	0.001
ALT(U/L)	89.5(41.9~126.0)	50.5(78.9~130.1)	Z=-0.033	0.973
AST(U/L)	64.6(43.0~87.8)	90.9(52.1~125.1)	Z=-2.319	0.020
GGT(U/L)	67.8(60.4~111.0)	66.4(29.6~130.9)	Z=-0.718	0.473
ALP(U/L)	114.8(75.8~161.7)	104.4(71.0~155.5)	Z=-0.661	0.509
TBil(μmol/L)	78.9(26.1~130.2)	83.5(57.3~133.1)	Z=-0.932	0.352
白蛋白(g/L)	29.4(27.0~33.6)	26.9(23.5~29.6)	Z=-2.643	0.008
血氨(μmol/L)	48(42~62)	64(69~80)	Z=-5.331	0.001
凝血酶原时间(s)	16.8(14.5~17.9)	17.9(15.9~18.9)	Z=-1.982	0.047
胆碱酯酶(U/L)	3567(3274~4148)	2399(2024~2781)	Z=-6.594	0.001

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2.2   Logistic回归及ROC曲线分析

对AST、白蛋白、血氨、凝血酶原时间和胆碱酯酶进行Logistic回归分析，以预测诊断肝硬化合并MHE的标志物，其中血氨和胆碱酯酶被选为MHE的独立预测因子。胆碱酯酶、血氨及两者联合检测的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.925、0.845和0.941，最佳截断值分别为2966、60和0.513(P值均＜0.05)(图 1，表 2)。

图  1  研究指标的ROC曲线分析

Figure  1.  ROC curve analysis of research indicators

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表  2  单变量和多变量分析的诊断效能

Table  2.  Diagnostic efficacy of univariate and multivariate analysis

变量	截断值	AUC	敏感度(%)	特异度(%)	约登指数
胆碱酯酶	＜2966	0.925	86.1(70.5~95.3)	91.1(78.8~97.5)	0.772
血氨	＞60	0.845	94.4(81.3~99.3)	75.6(60.5~87.1)	0.700
胆碱酯酶+血氨	＞0.513	0.941	91.7(77.5~98.2)	84.4(70.5~93.5)	0.761

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2.3   Child-Pugh分级分析

Child-Pugh分级中年龄和性别均无差异。但血氨随着Child-Pugh分级的增高而增加，胆碱酯酶随着Child-Pugh分级的增高而降低(P值均＜0.01)(表 3)。

表  3  MHE和肝硬化患者Child-Pugh分级分析

Table  3.  Child-Pugh grading analysis of patients with minimai hepatic encephalopathy and cirrhosis

统计变量	Child-Pugh A级(n=35)	Child-Pugh B级(n=25)	Child-Pugh C级(n=21)	统计值	P值
男/女(例)	24/11	15/10	14/7	χ2=0.493	0.782
年龄(岁)	49(43~55)	52(56.5~39.5)	55(43~57.5)	H=1.840	0.398
胆碱酯酶(U/L)	3790(3423~4432)	2980(2756~3153)1)	1966(2236~2521)1)2)	H=69.813	0.01
血氨(μmol/L)	45(37~56)	46(41~71)	65(60~74)1)2)	H=25.126	0.01
注：与Child-Pugh A级比较，1)P＜0.05；与Child-Pugh B级比较，2)P＜0.05。

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3.   讨论

肝性脑病是急性和慢性肝功能不全患者的严重并发症。它包括一系列神经或精神综合征，从MHE到肝性脑病，再到显性肝性脑病，最终发展为昏迷或死亡^[17]。MHE是一种相对早期、轻微的阶段，具有非典型的临床体征或症状，但可能会引发一系列认知相关的功能障碍^[18-19]。MHE的发生对患者及其照顾者的健康和生活质量产生巨大影响^{[2, 20]}并与高病死率相关^[21]。因此，MHE的早期诊断对控制病情和提高生存率具有重要意义。

本研究发现，与单纯肝硬化患者相比，MHE患者的常规肝功能(AST)、白蛋白、凝血酶原时间、血氨和胆碱酯酶水平都有不同程度的恶化，这表明MHE患者已经存在肝损伤，并且比单纯肝硬化患者的肝损伤更严重，即常规肝功能、白蛋白、凝血酶原时间、血氨和胆碱酯酶水平在区分单纯肝硬化和MHE患者方面具有一定的效能。但本研究经Logistic回归后显示只有胆碱酯酶和血氨是肝硬化合并MHE的独立预测因子，间接提示胆碱酯酶和血氨对MHE的早期诊断具有潜在的临床价值，这与Tan等^[22]的研究结果一致。这种联系可能具有一定的因果关系，因为MHE的发生与肝硬化进展相关^[23]，当MHE发生时可能会引发脑水肿、颅内高压等，进一步导致代谢紊乱，将可能再次加重肝功能水平恶化。有学者^[24]发现，白蛋白在肝性脑病患者的诊断和预测中也有一定的临床价值，但在本项研究中尚未观察到白蛋白水平与MHE诊断的相关性。笔者推测，Riggio等^[24]的研究以肝性脑病患者为主，此时患者肝损伤较为严重，身体状况差，易伴发腹水、感染等其他并发症，进一步导致肝功能恶化，对肝性脑病的诊断可能具有一定的价值，而本研究仅收集MHE患者，肝损伤较轻，对MHE的诊断效能欠佳，由此与既往研究存在差异。

本研究证实胆碱酯酶和血氨在MHE早期诊断中具有一定的价值，有可能成为MHE诊断的新工具，同时发现胆碱酯酶相比于血氨具有更高的诊断和预测价值。已有研究^[25]发现，利用血氨评估是否存在肝性脑病具有较高的敏感度，但特异度较低，因为血氨在检测过程中假阳性率较高，这与本研究结果一致(敏感度94.4%, 特异度75.6%)。本研究在收集患者过程中也发现，血氨正常的肝硬化患者存在轻微的认知缺陷(NCT-A和DST评分较低)，血氨水平正常并不能排除MHE。值得注意得是，将胆碱酯酶与血氨联合检测发现其AUC值为0.941，提示两者联合检测的诊断效能高于单独检测，具有更高的准确性，并且通过ROC曲线分析确定了胆碱酯酶与血氨联合诊断MHE发生的最佳截断值为0.513，联合检测可排除一部分使血氨非特异性升高的干扰因素，从而增加MHE诊断特异性。

Child-Pugh分级是临床上对肝硬化患者肝脏储备功能进行量化评估的最常用评估系统^[26]，Djiambou-Nganjeu等^[27]发现Child-Pugh分级在评估患者认知状况方面具有较好的临床价值，随着肝功能水平的恶化，其认知损害不断加重。本研究发现血氨和胆碱酯酶与肝功能水平(Child-Pugh)显著相关，提示血氨和胆碱酯酶水平对肝功能及其对认知功能障碍患者的预测及早期诊断具有较好的临床意义，可以对肝硬化患者进行及时、便捷监测，对MHE的出现进行预警，为临床早期诊断以及采取合理的干预措施提供依据，以使MHE患者得到早期治疗，进而改善患者的不良预后。

本研究存在一定的局限性。首先，受试对象较少，结果可能存在偏倚。其次，主要以乙型肝炎肝硬化患者为研究对象，受试者病因单一，在后续研究中应进行多病因、大样本研究，以进一步探究血清标志物在肝硬化合并MHE患者患病情况及早期诊断中的预测价值。

综上所述，本研究结果初步提示血清生物标志物在诊断和预测MHE发生方面具有潜在的临床价值，胆碱酯酶和血氨可能是MHE诊断和指导临床治疗的潜在血清标志物，以及判断患者病情的生物学指标。胆碱酯酶联合血氨在MHE早期诊断中具有更高的准确性，可以在临床工作中辅助诊断肝硬化并发MHE，以期为MHE患者的早期治疗提供依据。