Value of alkaline phosphatase level after ursodeoxycholic acid treatment for one month and baseline red blood cell distribution width in predicting the treatment response of primary biliary cholangitis

1.   白蛋白的生理功能

人血白蛋白是血液循环中最丰富的蛋白质，完全由肝脏合成，健康成年人每天合成12～25 g白蛋白，约40%留存于血管内，其余存在于组织间隙或其他器官中，如皮肤、肌肉和肠道。白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质，约占55%。体质量70 kg的健康成年人，白蛋白的含量为250～350 g^［1］。白蛋白是一种单体多域大分子，独特的结构决定了其具有多种生理功能。

1.1   维持渗透压

75%~80%的总胶体渗透压与白蛋白有关，其影响特性源于与其分子质量直接相关的渗透效应（约2/3）和Gibbs-Donnan效应（约1/3）。后者包括带负电荷的白蛋白吸引带正电荷的分子，如Na⁺，从而诱导水从血管外腔室向血管内腔转移^［2］。因此，白蛋白可以维持胶体渗透压的稳定，促进水分代谢，辅助改善肝功能。

1.2   抗氧化

白蛋白含有35个半胱氨酸（cysteine，Cys）残基，其中34个参与17个二硫化键的形成，位于34位的Cys残基（Cys-34）提供了血浆中约80%的游离硫醇基团，而血浆中的游离硫醇基团通常作为各种氧化剂的主要清除剂^［3］，白蛋白表现出的重要抗氧化活性是其治疗作用的功效基础，血清氧化白蛋白水平随着肝病严重程度的增加而增加，导致机体内血清白蛋白抗氧化作用能力降低。

1.3   抗炎症

白蛋白可与多种炎症介质结合，并通过Toll样受体信号实现免疫应答^［4］，降低氧化应激反应，改善细胞氧化状态，结合和清除体内有毒物质，减轻肝脏的炎症反应。

1.4   结合与转运

白蛋白的三级结构呈心形，分为3个重复的同源结构域，每个结构域有A和B 2个独立的亚结构域^［5］，这使得白蛋白表现出很强的配体结合功能，为许多内源性物质（如脂肪酸、胆红素、激素等）和外源性化合物的结合提供了载体和仓库。严重的肝病会导致低白蛋白血症，导致可用结合位点减少，影响营养物质和代谢产物的运输。

1.5   其他功能

白蛋白还有维持血管内皮完整性和抗凝的功能^［6］，发挥维持屏障功能完整性、减轻内皮损伤和炎症，并在失血性休克后有恢复血管稳态的作用。

2.   白蛋白的结构与功能的关系

白蛋白分子的结构完整性对其生物学功能至关重要。在促炎和促氧化循环微环境中，白蛋白结构易受有害毒素的影响而发生改变^［7］。其中，Cys-34残基的氧化损伤是最常见的改变，与肝硬化的严重程度和全身炎症的程度相关。更重要的是，Cys-34残基的氧化状态可作为独立预测因子，用于评估患者1年的病死率^［8］。除了Cys-34残基外，转录后损伤还可以涉及其他分子位点（即N端和C端部分的截短、糖基化和二聚化）。随着总白蛋白池中损伤的积累，保持完全生理结构的部分同时减少。此外，氧化型白蛋白增强了外周人白细胞的促炎细胞因子合成，为使用还原型天然白蛋白替代治疗以限制肝硬化中的全身炎症提供了理论依据。同时，随着肝硬化严重程度的增加，白蛋白功能出现改变，降低了原有的结合和解毒能力、抗氧化功能和螯合金属离子的能力^［9］。

目前，较为成熟的白蛋白功能检测评估方法包括羟基自由基抗氧化能力（hydroxyl radical antioxidant capacity，HORAC）测定、白蛋白结合能力（albumin binding capacity，ABiC）测定和缺血修饰白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）测定。HORAC能够评估白蛋白的总体抗氧化能力；ABiC能够评估白蛋白重要的药物结合位点——结合位点Ⅱ的结合能力；IMA能够评估白蛋白氮端螯合金属离子的结合力^［10-12］。

3.   肝脏疾病中白蛋白结构及功能的改变

Domenicali等^［13］研究发现，肝硬化患者的白蛋白结构发生了广泛的变化，其中最常见的结构异常是Cys-34残基的半胱氨酸化和糖基化。在晚期肝硬化患者中，循环半胱氨酸与白蛋白Cys-34位点的游离磺酰基发生可逆氧化反应，形成半胱氨酸化蛋白；同时，Cys-34残基不可逆氧化引起的磺酰化白蛋白水平显著升高。因此，白蛋白的可逆和不可逆氧化被认为是肝硬化过程中的后期事件。此外，患者体内的糖基化白蛋白水平显著增加，且其胆红素结合能力降低了50%，导致了白蛋白的结合和解毒能力显著下降。

意大利一项前瞻性、观察性研究^［14］纳入337例肝硬化患者，其中门诊收治的代偿期患者18例，住院过程中出现急性失代偿事件的患者319例，评估患者的有效白蛋白水平、白蛋白功能变化等情况。与门诊患者相比，住院患者的白蛋白结合和解毒效率均显著下降。

肝硬化的特点是全身炎症以及氧化应激增加，随着肝硬化的进展，血清白蛋白水平下降，与肝硬化和感染患者的死亡风险增加有关。在肝硬化患者中，肝细胞功能的损伤和肝细胞数量的减少，包括白蛋白和各种凝血因子在内的蛋白质合成不足，导致低白蛋白血症，通过血液稀释、水钠储留，以及白蛋白在细胞外和腹水中的隔离，白蛋白水平可以降低60%～80%^［15］。体内白蛋白水平的大幅减少将加速肝功能不全的进展，改变的白蛋白随着肝硬化的进展而增加，这意味着在晚期肝病患者中，白蛋白的抗氧化、清除和结合活性急剧下降，导致免疫力降低，感染概率增加、腹水及自发性细菌性腹膜炎等发生概率增加，多器官功能障碍出现，严重影响患者的预后和长期生存，病死率增加。

4.   白蛋白治疗失代偿期肝硬化的临床研究进展

白蛋白的抗炎和抗氧化特性有助于拮抗肝硬化的病理进展。ANSWER试验是一项多中心、随机、平行、开放标签临床研究，旨在评估长期使用人血白蛋白对无其他并发症的肝硬化腹水患者的影响。与标准治疗相比，常规治疗联合白蛋白治疗组的18个月生存率显著提高，死亡风险降低了38%。结果提示，长期使用人血白蛋白可以延长失代偿期肝硬化患者的总体生存期，具有一定的成本效益和良好的安全性。这些结果可能促使白蛋白的使用从针对特定并发症转变为一种更全面的方法，旨在通过作为一种改善疾病的治疗手段来减缓失代偿期肝硬化的进展^［7］。

4.1   失代偿期肝硬化合并糖尿病

既往研究显示，约31%的肝硬化患者患有糖尿病，其中大多数为2型糖尿病。ANSWER试验事后分析（post-hoc analysis）旨在评估长期白蛋白给药对失代偿期肝硬化合并2型糖尿病患者肝脏相关并发症发生率和生存率的影响^［16］。结果显示，在合并失代偿期肝硬化和腹水的2型糖尿病门诊患者中，长期白蛋白治疗与更好的生存率和较低的肝硬化相关并发症发生率相关。

4.2   失代偿期肝硬化合并低钠血症

低钠血症是肝硬化患者中最常见的电解质紊乱，根据血清钠<130或135 mmol/L的不同标准，其发生率为21%～50%。ANSWER试验事后分析显示，经过3个月的治疗，低钠血症的累积纠正率在常规治疗联合白蛋白治疗组与常规治疗组中分别为71%和44%（P=0.006），提示长期人血白蛋白治疗可改善低钠血症并减少门诊肝硬化腹水患者中度低钠血症的发生^［17］。

4.3   慢加急性肝衰竭（ACLF）

ACLF是一种高病死率的严重肝疾病。Fernández等^［18］的随机对照试验显示，白蛋白联合抗生素治疗不仅能显著改善ACLF患者的循环和肾功能，还能降低医院获得性感染的发生率。研究发现，与单用抗生素相比，联合治疗组患者的ACLF缓解率显著提高，医院获得性感染的发生率显著降低。白蛋白的作用机制可能与其抗炎和免疫调节作用有关。在治疗的前7天内，联合治疗组患者的炎症指标如C反应蛋白、白细胞介素-6和白细胞计数水平显著下降，表明白蛋白能够有效抑制全身性炎症。白蛋白还能通过改善平均动脉压、血清钠水平和肾功能，显著改善患者的总体预后。

4.4   酒精性肝病（ALD）

ALD的发病机制与氧化应激密切相关。Naldi等^［19］的研究通过质谱分析揭示，酒精性肝炎患者的血清白蛋白具有显著的微观异质性，这种异质性与后转录修饰密切相关，尤其是在胱氨酸和蛋氨酸残基的氧化修饰方面。Das等^［20］研究进一步发现，酒精性肝炎患者的白蛋白氧化状态显著升高，其中不可逆氧化形式中性粒细胞抗体-2的比例增加。这种氧化修饰降低了白蛋白的抗氧化能力，使其从抗氧化剂转变为促炎因子，从而诱导中性粒细胞活化和活性氧的产生，最终加剧肝脏炎症和损伤。

4.5   非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）

NAFLD是指除了酒精以及其他明确的肝损伤因素以外而导致的肝内脂肪过度沉积，现在已更名为代谢相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD），尽管当前尚无针对NAFLD的特定疗法，基于白蛋白的药物递送系统已成为潜在的治疗策略。Jing等^［21］的研究开发了一种基于牛血清白蛋白的自组装纳米复合物BAM15@BSA，用于改善NAFLD的治疗效果。研究表明，这种复合物通过增强药物的水溶性、稳定性和肝靶向性，显著改善了药物的治疗效果。

5.   有效白蛋白检测技术的开发及应用前景

5.1   “有效白蛋白”概念的提出与临床意义

2013年，Jalan等^［22］提出了“有效白蛋白”这一概念，重新定义了白蛋白在慢性疾病中的评估方式。Jalan等指出，由于白蛋白在肝病、肾病等慢性疾病中经历氧化、糖基化等翻译后修饰，导致其抗氧化和运输功能受损，因此，单纯测量总白蛋白水平并不能全面反映其在疾病状态下的生物活性。这一概念强调了白蛋白结构完整性和功能性修饰的重要性，建议测量具有功能的白蛋白水平，以更精确地评估患者的病情和治疗效果。

随后，Domenicali等^［13］通过研究肝硬化患者的白蛋白异构体变化，进一步支持了“有效白蛋白”概念。研究发现，白蛋白结构损伤与特定并发症（如腹水和肾功能障碍）显著相关，某些特定异构体在预测1年生存率方面比总白蛋白更有效，凸显了白蛋白结构修饰在疾病预后中的价值。

Baldassarre等^［14］进一步探讨了有效白蛋白在失代偿性肝硬化患者中的应用，指出有效白蛋白能更准确地区分急性失代偿与ACLF，并且在预测30天内肝衰竭和90天内病死率方面优于传统指标总白蛋白水平。尽管短期内白蛋白输注可提高有效白蛋白，但改善作用不持久，提示需要探索更有效的治疗策略。这些研究共同指出，白蛋白的结构修饰在疾病预后评估中具有重要作用，且有效白蛋白在个性化疾病管理中展现出较大的应用潜力。

5.2   电子顺磁共振技术在白蛋白功能分析上的应用

Kazmierczak等^［23］利用电子顺磁共振技术分析白蛋白的结合和解毒功能，研究了不同乙醇浓度下白蛋白与脂肪酸等分子的结合特性，并通过测量结合效率和解毒效率，评估白蛋白的运载和解毒功能。这种方法能够提供高灵敏度的结合信息，揭示白蛋白功能在病理状态下的变化。然而，该技术操作复杂，对实验条件和仪器精度要求较高，因此，在临床上常规应用仍面临挑战。

2017年，Watanabe等^［24］探讨了白蛋白在慢性疾病中的翻译后修饰，特别是Cys-34位点的氧化，发现其在慢性肝病、肾病和糖尿病患者中随病情进展而增加。研究显示，支链氨基酸治疗可部分逆转这种修饰，提示白蛋白结构完整性对慢性疾病的诊断和治疗效果预测具有重要意义。

Clària等^［25］研究了高级氧化蛋白产物（advanced oxidation protein product，AOPP）和IMA在药物性肝损伤（DILI）中的作用，发现这些标志物在重症患者中的水平显著升高，且在治疗后下降，表明其可有效反映氧化应激水平和病情严重程度。研究指出，尽管AOPP和IMA在急性肝损伤监测中有应用价值，但需在更多肝损伤类型中验证其特异性。

Xiao等^［26］研究了DILI患者中AOPP和IMA的作用，探讨其在氧化应激监测中的潜力。结果显示，DILI患者的AOPP和IMA水平显著高于健康对照组，尤其在重症患者中更为明显，表明这些生物标志物能够反映氧化应激水平，并在治疗后显著降低，提示其监测治疗效果的潜在价值。

5.3   高效液相色谱-质谱联用分析白蛋白结构

Lakis等^［27］分析了检测有效白蛋白时结合“自上而下”和“自下而上”两种质谱分析方法，可以全面解析白蛋白的结构和功能。

“自上而下”方法利用高效液相色谱-质谱联用直接分析未消化的蛋白，通过解卷积获得同种型的结构信息，保持蛋白整体性，但因算法限制可能产生误差。相较之下，“自下而上”方法对蛋白酶解后分析片段，通过数据库比对确认结构，适合高通量样品分析，但酶解可能导致部分结构信息丢失。结合这两种方法，分别实现全局结构分析和局部验证，有助于提高检测全面性。

Rahali等^［28］也采用“自下而上”方法分析人血白蛋白，发现其能够快速揭示蛋白的序列和修饰信息，但对质量精度要求较高，部分修饰可能在质谱误差范围内被忽视。去卷积分析还存在误差累积风险。然而，该方法在识别和量化白蛋白同种型方面具备显著优势，尤其在异构体分析中，为深入理解白蛋白的结构功能提供了高分辨率的信息。

尽管上述研究尚存在改进精度和稳定性能的优化空间，但“自上而下”与“自下而上”的结合，显著提升了白蛋白结构解析的完整性和准确性，为其功能分析提供了坚实基础。

5.4   结构变化的白蛋白作为生物标志物在临床诊断中的应用

Chen等^［29］研究了IMA在评估慢性肝病患者肝功能中的潜力，发现肝硬化患者的IMA水平显著升高，表明白蛋白结构的完整性受损与肝功能的减退密切相关。通过观察白蛋白N端金属结合能力的降低，Chen等推测IMA可以作为肝病进展的生物标志物。然而，其研究也面临特异性不足的问题，因为IMA水平不仅受肝病影响，还可能受到其他缺血性事件或病理状态的干扰，从而限制了其独立应用于肝功能评估的准确性。

Giannone等^［30］则进一步探讨了IMA在肝硬化患者中作为细菌感染标志物的应用价值，发现感染状态下患者的IMA水平显著升高，提示白蛋白在应激和感染环境中其结构和功能出现变化。这项研究揭示了IMA作为细菌感染诊断工具的未来潜力，拓宽了其临床应用范围。然而，Giannone等也指出，尽管IMA对感染的敏感性较高，但在感染诊断中的特异性较低，因为该指标同样可能受到其他缺血性因素的影响，导致假阳性情况。

Sun等^［31］开发了一种基于丹磺肌氨酸的荧光滴定法，用于评估白蛋白的药物结合功能，特别关注其在NAFLD中的评估价值。该方法通过检测位点3的结合能力反映白蛋白的功能状态，操作简单且敏感性高，适合临床应用。然而，Sun等的方法局限于特定位点的检测，无法全面反映白蛋白的其他结合位点和整体功能，这在复杂病理环境中可能限制了其应用范围。

另一方面，Tada等^［32］提出了一种简单的比色法，利用Michler’s Hydrol染料和溴甲酚紫，测定人血白蛋白中巯基白蛋白的浓度及比例，以快速评估白蛋白的氧化还原状态。此方法已在心肌缺血等临床诊断中得到应用，且方法简便、成本低。然而，该方法主要测定N端截断的白蛋白，并不适用于其他修饰或截断类型的白蛋白分析。因此，尽管该方法为白蛋白氧化还原状态提供了快速的临床检测手段，但其对不同白蛋白亚型的分析能力较为有限，限制了其诊断的应用潜力。

综上，有效白蛋白作为一种多维度的生物标志物，展示了其在慢性肝疾病全病程管理中的应用潜力。通过结合“自上而下”和“自下而上”的质谱分析方法，研究人员能够更全面地解析白蛋白的结构改变；同时，基于电子顺磁共振等技术的功能性检测，为理解白蛋白在病理环境中的动态变化提供了更多可能性。然而，当前的检测方法仍存在标准化不足及检测费用高等挑战。

6.   小结与展望

自1962年开始第一项人血白蛋白治疗相关的随机对照试验以来，白蛋白个性化治疗方案一直在不断探索中，“有效白蛋白”概念的提出及检测手段的进步，更加关注白蛋白结构与功能对临床疗效及疾病结局的影响；“有效白蛋白”检测用于市场销售白蛋白的质量评估手段，在不远的将来，对提升白蛋白质量进而提高白蛋白临床治疗效果，将产生深远的影响。