Efficacy of endoscopic retrograde cholangiopancreatography combined with electrohydraulic lithotripsy under the direct view of eyeMax biliary-pancreatic imaging system in treatment of difficult choledocholithiasis

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进一步进展为肝硬化和肝细胞癌的关键环节。随着肥胖和代谢综合征的流行，NASH和NAFLD已成为全球慢性肝病的最主要病因，严重危害人民生命健康^［1］。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上对转录组进行扩增和测序的新技术^［2］。相比于传统的转录组测序，单细胞RNA测序对了解肝脏非实质细胞，如炎症细胞尤为有效^［3］。Su等^［4］通过scRNA-seq分析发现了健康和NAFLD小鼠肝脏中非实质细胞的基因表达谱改变。T淋巴细胞是细胞免疫反应的效应细胞。近年来，人们逐渐认识到T淋巴细胞在NAFLD发病过程中的重要作用。Koda等^［5］发现，CD69⁺CD103^-CD8⁺T淋巴细胞在高脂高胆固醇诱导的NASH小鼠肝脏中显著富集。有研究发现，NAFLD患者的外周血中炎症因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β1的水平和辅助性T淋巴细胞（Th）17的水平呈正相关^［6］，且Th17细胞和IL-17的水平与NASH患者的病情严重程度呈正相关^［7］。但在单细胞水平上研究T淋巴细胞在NASH中的特征改变仍是有必要的。因此，本研究采用scRNA-seq技术对健康小鼠和NASH小鼠的肝组织内T淋巴细胞进行分群，旨在揭示NASH小鼠肝组织中不同T淋巴细胞亚群的转录组学特征。

1.   资料与方法

1.1   实验动物

选取8周龄C57BL/6雄性小鼠6只，随机分为对照组和NASH组，每组各3只。对照组喂养普通饲料，NASH组喂养胆碱蛋氨酸缺乏（methionine-choline-deficient， MCD）饲料，造模6周后处死小鼠，取肝组织进行scRNA-seq以获得基因表达谱数据（上海鲸舟基因科技有限公司）^［8］。

1.2   研究方法

1.2.1   scRNA-seq

使用Seurat 3.0软件包读取scRNA-seq数据，并为每个数据创建一个Seurat对象。排除独特分子标志<200或>10 000的细胞及线粒体基因含量高于25%的细胞，并根据独特分子标志细胞总计数进行对数标准化后，对前2 000个高可变基因使用主成分分析的降维算法进行降维，随后基于主成分分析降维结果以0.6的分辨率进行聚类。

1.2.2   细胞注释和分簇

使用Seurat 3.0中的FindAllMarkers函数筛选出所有细胞类群中的标志基因，并使用R包Single R 1.4.1内置的小鼠RNA测序数据库作为参考数据集对细胞亚群进行细胞类型注释。通过白细胞分化抗原3α（the cluster of the differentiation 3α，Cd3α）、白细胞分化抗原8α（Cd8α）、白细胞分化抗原4（Cd4）和T淋巴细胞受体α（T cell receptor alpha，Tcrα）来鉴定T淋巴细胞。

1.2.3   特异性差异表达基因（以下简称“特异性基因”）分析

使用Seurat3.0中的FindMarkers函数用于筛选scRNA-seq数据中的差异表达基因，设置log₂（FC）>0.25为阈值，并对基因的显著性P值进行检验矫正。随后使用t分布随机邻域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）对数据进行可视化，再通过小提琴图来可视化每个聚类中表达的特异性基因。

1.2.4   功能富集分析

采用Cluster Profiler R软件包对特异性基因集进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO数据库是从生物学过程、细胞组分、分子功能3个方面对基因和基因产物进行分类注释。

1.2.5   免疫荧光染色

分别将对照组小鼠和NASH组小鼠肝脏切片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复和血清封闭后，加入以下一抗：Tcrα（Abcam公司，货号：ab288432）、Tcf7（Abcam公司，货号：ab315392）和Cxcr6（Boster公司，货号：BA3082），并置于4 ℃冰箱中孵育过夜。次日滴加Alexa 488（Yeasen公司，货号：34106ES60）、Alexa 594（Yeasen公司，货号：33112ES60）标记的荧光二抗和DAPI染液后封片。抗体稀释倍数均为1∶200。使用荧光显微镜拍照观察，并用Image J1.8.0软件进行荧光面积占比测定。

1.3   统计学方法

使用SPSS 19.0、Graphpad prism 10和Image J软件对荧光免疫结果进行统计分析和可视化处理。计量资料采用x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验。特异性基因分析中的P值用Seurat 3.0软件包中的Wilcoxon秩和检验和Bonferroni校正来检验，富集分析通过ClusterProfiler函数实现，并使用Fisher精确检验和FDR矫正。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   NASH小鼠肝组织T淋巴细胞亚群的分群和各亚群的变化

从NASH组小鼠和对照组小鼠的肝脏中分离出单细胞，得到来自对照组的4 336个细胞和来自NASH组的3 893个细胞^［8］。通过分析所有细胞中表达不同的基因，共鉴定出21个细胞簇。其中，第6、7簇被鉴定为T淋巴细胞（图1a）。比较两组T淋巴细胞亚群的占比情况发现，第6簇T淋巴细胞的比例从对照组的58.5%降低到NASH组的48.7%，而第7簇T淋巴细胞则从对照组的41.5%增高到NASH组的51.3%（图1b）。热图显示了第6、7簇T淋巴细胞前10位特异性基因（图1c）。

注： a，小鼠肝组织中T淋巴细胞亚群的t-SNE分析，其中左图显示21个细胞簇（绿色的2簇为T淋巴细胞簇），右图显示第6、7簇T淋巴细胞簇；b，第6、7簇T淋巴细胞在对照组和NASH组中的占比；c，热图显示第6、7簇T淋巴细胞前10位特异性基因。

图  1  NASH组小鼠肝组织T淋巴细胞亚群的分群和各亚群的变化

Figure  1.  Definition of T cell subsets and changes in each subpopulation in the liver tissues of NASH mice

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2.2   第6簇T淋巴细胞的转录组学特征

为进一步研究第6簇T淋巴细胞的转录组学特征，通过t-SNE分析显示，第6簇T淋巴细胞的前10位特异性基因，包括神经元特异性基因2（neuron-specific gene 2，Nsg2）、白细胞分化抗原8b1（the cluster of the differentiation 8 subunit beta 1，Cd8b1）、Cd8a、转录因子7（transcription factor 7，Tcf7）（图2a）和其他6个特异性基因（表1）。通过小提琴图显示第6簇前4位特异性基因（图2b）。表1显示，65%的第6簇T淋巴细胞表达Tcf7（pct_FC排名第4，但pct_FC前三的基因在第6簇T淋巴细胞中的表达率均低于50%）。因此Tcf7作为第6簇T淋巴细胞的特征标志基因，定义为Tcf7⁺T淋巴细胞亚群。KEGG途径富集分析显示，第6簇T淋巴细胞参与T淋巴细胞受体、Th17细胞分化和Th1、Th2细胞分化等多个炎症相关信号通路的调控（图2c）。GO富集分析结果显示，第6簇T淋巴细胞特异表达基因主要参与活化T淋巴细胞、白细胞细胞间黏附、磷酸化的负调控的生物学过程，核糖体、肌动蛋白细胞骨架、细胞质的细胞组分，以及结合mRNA、结合泛素样蛋白连接酶、结合鸟苷酸的分子功能（图2d）。

注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第6簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第6簇T淋巴细胞的特异性基因的KEGG通路富集分析（c）和GO富集分析（d）。

图  2  第6簇T淋巴细胞的转录组学特征

Figure  2.  The transcriptomic characteristics of Cluster 6

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表  1  第6簇T细胞前10位特异性基因

Table  1.  Top10 specific DEGs of Cluster 6

基因	P值	avg_logFC	pct.1	pct.2	校正后的P值	pct_FC
Nsg2	5×10-324	0.77	0.25	0.001	5×10-324	253.99
Cd8b1	5×10-324	1.89	0.49	0.012	5×10-324	40.42
Cd8a	5×10-324	1.67	0.44	0.014	5×10-324	31.36
Tcf7	5×10-324	1.95	0.65	0.027	5×10-324	24.22
Sidt1	1.63×10-303	0.92	0.31	0.013	3.89×10-299	24.15
Cd5	4.64×10-292	1.06	0.32	0.016	1.11×10-287	19.99
Lef1	5×10-324	1.24	0.42	0.025	5×10-324	16.64
Themis	3.21×10-241	0.84	0.30	0.018	7.66×10-237	16.44
Cd247	1.03×10-282	0.91	0.35	0.022	2.44×10-278	15.99
Bcl11b	5×10-324	1.57	0.60	0.039	5×10-324	15.44
注：avg_logFC，平均对数倍数变化； pct.1，在第6簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比； pct-FC，百分比倍数变化。

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2.3   第7簇T淋巴细胞的转录组学特征

t-SNE分析发现，第7簇T淋巴细胞特异性表达白细胞分化抗原40配体基因（Cd40lg）、γ链T细胞受体抗原1（T-cell receptors gamma-chain 1， Tcrg-C1）、白细胞介素2受体α（interleukin-2 receptor α，Il2rα）、CXC趋化因子受体6（C-X-C motif chemokine receptor 6，Cxcr6）（图3a）和其他6个基因（表2）。通过小提琴图显示出第7簇前4位特异性基因（图3b）。表2显示，在第7簇中，90%的T淋巴细胞表达Cxcr6（pct_FC排名第4，且pct_FC排名前3位的基因在第7簇T淋巴细胞中表达率均低于50%）。因此Cxcr6是第7簇T淋巴细胞的特征标志基因，定义为Cxcr6⁺T淋巴细胞亚群。KEGG途径富集分析显示，第7簇显著富集的通路包括T淋巴细胞受体信号通路、Th17细胞分化和MAPK信号通路（图3c）。GO富集分析显示，第7簇的特异性基因主要参与T淋巴细胞活化、免疫效应过程的调控、细胞因子产生的生物学过程，细胞质、核糖体、神经元间突触的细胞组分，以及结合嘌呤核糖核苷、结合GTP、泛素样蛋白连接酶的分子功能（图3d）。

注： t-SNE图（a）和小提琴图（b）显示第7簇T淋巴细胞的前4位特异性基因；第7簇T淋巴细胞的特异性基因的GO富集分析（c）和KEGG通路富集分析（d）。

图  3  第7簇T细胞的转录组学特征

Figure  3.  The transcriptomic characteristics of Cluster 7

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表  2  第7簇T淋巴细胞前10位特异性基因

Table  2.  Top10 specific DEGs of Cluster 7

基因	P值	avg_logFC	pct.1	pct.2	校正后的P值	pct_FC
Cd40lg	7.69×10-294	0.73	0.26	0.006	1.83×10-289	42.50
Tcrg-C1	5×10-324	1.56	0.46	0.013	5×10-324	35.00
Il2ra	5×10-324	0.99	0.34	0.011	5×10-324	31.00
Cxcr6	5×10-324	2.32	0.90	0.04	5×10-324	22.50
Klrb1c	5×10-324	1.53	0.58	0.03	5×10-324	19.47
Tcrg-C2	5×10-324	1.48	0.44	0.023	5×10-324	19.04
Prrt1	3.39×10-258	0.87	0.32	0.017	8.09×10-254	18.76
Tcrg-C4	7.30×10-290	1.16	0.37	0.02	1.74×10-285	18.50
Il12rb2	9.05×10-193	0.64	0.25	0.014	2.16×10-188	17.93
Cd160	5×10-324	1.12	0.45	0.025	5×10-324	17.80
注：pct.1，在第7簇的表达百分比；pct.2，在其他细胞簇的表达百分比。

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2.4   免疫荧光验证NASH小鼠肝组织中两种T淋巴细胞的变化

免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，NASH组小鼠肝组织Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域显著减少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%， P<0.05）（图4a、b）；而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染阳性区域显著增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%， P<0.001）（图4c、d）。以上免疫荧光结果均与单细胞测序的分析趋势一致。

注： DAPI蓝色荧光代表细胞核，Tcrα蛋白红色荧光代表T淋巴细胞。a，绿色荧光为Tcf7，黄色箭头指Tcf7⁺Tcrα⁺T淋巴细胞（×630）；b，Tcf7⁺Tcrα⁺T淋巴细胞占比；c，绿色荧光为Cxcr6，黄色箭头指Cxcr6⁺Tcrα⁺T淋巴细胞（×630）；d，Cxcr6⁺Tcrα⁺T淋巴细胞占比。

图  4  免疫荧光显示T淋巴细胞亚群及特征标志基因的变化

Figure  4.  Immunofluorescence shows the changes of T cell subsets and of the expression of the most specific genes between the control and NASH group

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3.   讨论

NASH是NAFLD病情进展的关键阶段，以5%以上的肝细胞脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变为特征^［9］，是一种影响了全球约1/4人口的慢性肝脏疾病，可发展为肝硬化和肝癌^［10-11］，是当前研究热点之一。但NASH发病机制尚不完全清楚^［12］。

T淋巴细胞作为适应型免疫的重要组成成分，占肝脏内淋巴细胞的50%以上。根据识别抗原提呈细胞上不同类型的主要组织相容性复合物，T淋巴细胞可以被划分为CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞^［13］。Wolf等^［14］发现，在MCD饮食喂养的小鼠肝脏中，CD8⁺T淋巴细胞数量增高且活性增强，并引发由该种饮食所诱导的肝损伤，但不会影响肝内脂质代谢。Her等^［15］发现CD4⁺T淋巴细胞可能通过释放促炎因子IL-17A和干扰素γ促进NAFLD有关的炎症和脂肪变性向纤维化转变过程。

相比于传统细胞测序方法，单细胞测序不仅使获得的遗传信息更加精确，还能检测微量的基因表达水平^［16］。近年来，单细胞测序技术的应用促进了人们对慢性肝脏疾病中T淋巴细胞亚群复杂异质性的了解。Li等^［17］发现，与健康人群的肝脏相比，NAFLD患者肝脏内的CD4⁺T淋巴细胞数目增多，并发现了CD4⁺T淋巴细胞内4个差异表达基因（MIGI3、RCAN3、DOCK10和SAMD12）与NAFLD有关。Huang等^［18］发现，在NAFLD斑马鱼肝脏内，CD8⁺T淋巴细胞可分为6个亚群（CD8-gzmk、CD8-rorc、CD8-ccl38.6、CD8-lta、CD8-mki67和CD8-mcm4），而CD4⁺T淋巴细胞可分为4个亚群（CD4-foxp3a、CD4-cd28、CD4-cebpb和CD4-mki67）。

本研究通过对健康小鼠和MCD诱导的NASH小鼠的肝脏进行单细胞测序，重点研究筛选出的2个T淋巴细胞亚群：（1）第6簇T淋巴细胞在NASH小鼠肝脏中的占比从对照组的58.5%降低到NASH组的48.7%。65%的该簇T淋巴细胞表达Tcf7，因而作为该簇的标志基因。功能富集分析发现，该T淋巴细胞亚群主要发挥活化T淋巴细胞、白细胞细胞间黏附、结合泛素样蛋白连接酶等作用，并参与调控Th17、Th1、Th2细胞分化等多个炎症相关信号通路。免疫荧光染色结果证实，NASH组小鼠肝组织中Tcf7⁺T淋巴细胞较对照组减少。Tcf7基因编码产生T淋巴细胞因子1（T cell factor-1，TCF1），并参与Wnt/β连环蛋白信号通路，在分化T淋巴细胞方面发挥重要作用。Yu等^［19］发现，在Wnt/β连环蛋白信号通路的调节下，TCF1通过诱导Gata结合蛋白3的产生促进Th2的分化。Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4/5/6/10等，主要发挥抗炎作用^［20］。过度表达的TCF1可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，并抑制凋亡^［21］。Gui等^［22］发现，与原发性肝癌和正常肝组织相比，Tcf7⁺CD8⁺记忆T淋巴细胞特异性富集于转移性肝癌中。（2）此外，还发现第7簇T淋巴细胞的比例从对照组的41.5%增高到NASH组的51.3%。90%的该簇T淋巴细胞表达Cxcr6基因（作为标志基因）。GO富集分析提示，第7簇的特异性基因主要发挥T淋巴细胞活化和产生细胞因子的功能。KEGG通路富集分析发现，第7簇T淋巴细胞显著富集的通路包括T淋巴细胞受体信号通路、Th17细胞分化和MAPK信号通路。同时，免疫荧光结果显示，与对照组相比，NASH组小鼠肝组织中Cxcr6⁺T淋巴细胞增加。Cxcr6最初被发现表达于人类记忆T淋巴细胞^［23］，表达Cxcr6基因的CD8⁺T淋巴细胞可依赖IL-15促进肝细胞凋亡^［24］，激活Cxcr6通路可促进肝内自然杀伤T淋巴细胞聚集，进而加重肝内炎症反应并促进肝纤维化^［25］。但Tcf7⁺T淋巴细胞和Cxcr6⁺T淋巴细胞在NASH中的具体机制尚未有研究报道，有待进一步地深入研究。

综上所述，通过NASH小鼠肝脏的单细胞测序，在NASH中筛选出2个肝组织T淋巴细胞亚群：Tcf7⁺T淋巴细胞的占比降低，推测其可能通过促进Th2细胞的分化发挥抗炎作用；而Cxcr6⁺T淋巴细胞的占比增高，推测其可能通过MAPK信号通路发挥促炎作用。